An in vitro platform for the rapid and scalable biocatalysis of complex polyketides

De natuur heeft enkele van de meest geavanceerde chemische fabrieken die de wetenschap kent, gebouwd in minuscule bacteriën. Deze microscopische organismen bezitten lange, moleculaire assemblagelijnen van eiwit die eenvoudige bouwstenen aan elkaar kunnen klikken tot complexe, driedimensionale structuren. Deze structuren, bekend als polyketiden, zijn de bron van veel levensreddende medicijnen, waaronder antibiotica die infecties bestrijden en medicijnen die het immuunsysteem kalmeren. Decennialang hebben wetenschappers ervan gedroomd om deze natuurlijke assemblagelijnen uit de bacteriën te halen en in een reageerbuis te plaatsen. Het idee was om deze moleculaire machines direct te laten draaien, zonder de rommelige interferentie van een levende cel, om nieuwe medicijnen sneller en schoner te maken. Echter, vroege pogingen om dit te doen faalden. Wanneer onderzoekers probeerden deze assemblagelijnen buiten de cel te laten draaien, bewogen ze zo traag dat het proces zinloos leek; er werd bijna niets geproduceerd voordat de machinerie stopte met werken.

Een team van onderzoekers aan de University of Texas at Austin heeft nu dit langgekoesterde geloof weerlegd. Ze hebben een nieuwe manier ontwikkeld om deze moleculaire assemblagelijnen in een reageerbuis te laten draaien die snel, efficiënt en in staat is om grote hoeveelheden complexe chemicaliën te produceren. Door de eiwitdelen van de assemblagelijn zorgvuldig te herontwerpen en een systeem te creëren dat de brandstof die de machines nodig hebben constant aanvult, veranderde het team een traag proces in een snelle productielijn. Ze toonden aan dat deze biologische machines net zo snel kunnen werken als de meest efficiënte natuurlijke fabrieken in de natuur, waarbij ze eenvoudige ingrediënten in enkele uren omzetten in complexe, medicijnachtige moleculen. Deze doorbraak suggereert dat wetenschappers nu bibliotheken van nieuwe, complexe medicijnen in een laboratoriumsetting kunnen bouwen, waarbij ze de trage en dure methoden van traditionele chemische synthese of de onvoorspelbare aard van het kweken van bacteriën omzeilen.

Het verhaal begint bij een specifiek type moleculaire machine genaamd een polyketidesynthase. In de natuur zijn deze machines als enorme lopende banden gemaakt van eiwit. Ze nemen kleine, eenvoudige moleculen en voegen deze in een precieze volgorde samen om grotere, ingewikkelde structuren te bouwen. De volgorde van de onderdelen op de band bepaalt de vorm en functie van het eindproduct. Jarenlang probeerden wetenschappers deze machines in levende bacteriën te gebruiken om medicijnen te maken. Hoewel dit werkte, was het moeilijk te controleren. De bacteriën hadden hun eigen interne processen die concurreerden met de assemblagelijn, en het was moeilijk te zeggen of een lage opbrengst kwam door een fout in de machine of door de omgeving van de cel. Het verplaatsen van het proces naar een reageerbuis leek de logische oplossing, omdat het wetenschappers in staat zou stellen elke variabele te controleren. Maar toen ze dit voor het eerst probeerden, waren de machines ongelooflijk traag. Een beroemde poging om een machine te laten draaien die een antibioticum genaamd erythromycine maakt, liet zien dat deze met een glaciale snelheid bewoog en slechts een minimale hoeveelheid product produceerde voordat hij stopte. Dit leidde tot de wijdverspreide aanname dat deze complexe machines simpelweg niet goed werkten buiten hun natuurlijke thuis.

De onderzoekers zetten zich in om te bewijzen dat deze aanname onjuist was. Ze richtten zich op een andere machine, één die van nature een verbinding genaamd narbonolide produceert, die verwant is aan het antibioticum pikromycine. In plaats van de natuurlijke versie van de machine te gebruiken, die bestaat uit vier grote eiwitdraden, braken ze deze af in zes kleinere, meer hanteerbare stukken. Dit gerefactorde ontwerp maakte het gemakkelijker om de machine in het lab te produceren en correct te assembleren. Vervolgens testten ze deze nieuwe opstelling in een oplossing met de benodigde brandstof en bouwstenen. Aanvankelijk werkte de machine, maar het was nog steeds te traag om praktisch bruikbaar te zijn, en het product dat het maakte was fragiel en viel uiteen in de chemische omgeving van de reageerbuis. Het team realiseerde zich dat de machine tegen zichzelf vocht. Sommige delen van de machine produceerden ongewenste bijproducten en de brandstof werd verspild.

Om dit op te lossen, behandelden de onderzoekers de assemblagelijn als een complexe motor die afgesteld moest worden. Ze vervingen specifieke onderdelen van de machine, waarbij ze generieke connectoren vervingen door exemplaren die beter bij de specifieke taak pasten. Ze verplaatsten de labels die gebruikt werden om de eiwitten te identificeren naar andere posities op de draden om te zien of dit zou helpen om de stukken efficiënter aan elkaar te laten plakken. Ze voegden ook een speciaal reinigingsenzym toe dat fungeerde als een monteur, dat defecte onderdelen verwijderde die anders de assemblagelijn zouden blokkeren. Elke kleine aanpassing maakte de machine sneller. Tegen de tijd dat ze klaar waren met het optimaliseren van het ontwerp, werkte de machine op een snelheid die honderd keer sneller was dan de oude erythromycine-machine en vergelijkbaar met de snelheid van de meest efficiënte natuurlijke vetzuisfabrieken in de natuur. Het was niet langer een traag experiment; het was een hoogwaardige biocatalysator.

Het laatste puzzelstukje was het brandstofsysteem. Deze machines vereisen een constante toevoer van energie en specifieke bouwstenen om in beweging te blijven. In een levende cel zorgt de cel automatisch voor deze brandstof. In een reageerbuis raakt de brandstof snel op. Het team ontwikkelde een nieuw platform, dat ze het EPK-systeem noemen, dat fungeert als een zelfbijvullend station. Dit systeem bevat enzymen die de brandstof en de bouwstenen constant regenereren uit eenvoudige, goedkope ingrediënten. Met dit systeem in het achterhoofd konden de onderzoekers een reactie laten plaatsvinden in een klein bekertje bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Ze begonnen met een kleine hoeveelheid van de machine en eenvoudige ingrediënten, en de machine zette deze om in een grote hoeveelheid van het eindproduct. In slechts twee uur produceerden ze genoeg van de narbonolide-verbinding om een klein flesje te vullen, een hoeveelheid die met eerdere methoden dagen of weken had geduurd.

Het succes van dit platform ging verder dan alleen het maken van één verbinding. De onderzoekers gebruikten hetzelfde geoptimaliseerde systeem om vier andere complexe moleculen te bouwen, elk met een iets andere vorm. Omdat het proces zo schoon en vrij van de ruis van een levende cel was, konden ze deze producten in pure vorm isoleren. Dit stelde hen in staat om de exacte driedimensionale structuur van de moleculen te bepalen met behulp van röntgencristallografie, wat details onthulde die nog nooit eerder waren gezien. Een van de moleculen die ze maakten, had een structuur die een spiegelbeeld was van een bekende verbinding, een subtiel verschil dat vaak over het hoofd wordt gezien in levende cellen, maar hier duidelijk zichtbaar was. De mogelijkheid om deze complexe vormen in pure vorm te produceren, opent de deur naar het creëren van enorme bibliotheken van nieuwe chemische structuren. Wetenschappers kunnen nu verschillende onderdelen van de assemblagelijnen mengen en combineren om duizenden nieuwe variaties te creëren en deze te testen op medicinale eigenschappen, zonder de beperkingen van het kweken van bacteriën.

Dit werk verandert het landschap van hoe complexe medicijnen gemaakt kunnen worden. Het bewijst dat de traagheid van deze moleculaire machines geen fundamentele fout was, maar het gevolg van een slecht ontwerp en een gebrek aan passende ondersteuningssystemen. Door de machines te herbouwen en hen te voorzien van een constante stroom brandstof, hebben de onderzoekers een nieuwe manier ontsloten om de krachtigste synthetische instrumenten van de natuur te benutten. Het proces is nu snel genoeg om praktisch te zijn en schoon genoeg om hoogwaardige materialen te produceren voor medicijnontwikkeling. Hoewel de technologie zich nog in een vroeg stadium bevindt, laten de resultaten zien dat de toekomst van het maken van complexe medicijnen wellicht niet ligt in het kweken van meer bacteriën of het bouwen van meer chemische fabrieken, maar in het verfijnen van de moleculaire assemblagelijnen die de natuur al heeft geperfectioneerd. De deur staat nu open om een enorme chemische ruimte te verkennen, wat nieuwe mogelijkheden creëert voor de behandeling van ziekten die lang moeilijk bereikbaar waren.