Volumetric nanoscale localization using engineered point spread functions in light sheet microscopy

技術要約：ライトシート顕微鏡におけるエンジニアード点広がり関数を用いた体積ナノスケール局在化

問題提起
ナノスケールの三次元局在化を、大規模な生物学的ボリューム全体にわたって実現することは、光学顕微鏡における重要な課題である。既存のアプローチは通常、撮像速度、体積視野（FOV）、および局在精度との間でトレードオフに直面する。エンジニアード点広がり関数（ePSF）は、機械的な切片形成なしに3D局在化を可能にするが、軸方向の範囲を拡張すると局在精度が低下し、エミッターの重なりを避けるために希薄なラベル付けが必要になる。逆に、高密度のエミッターを扱うことが可能な手法は、軸方向の範囲が（約8 µm以下と）狭い範囲に限定されることが多い。その結果、ナノメートル規模の精度と拡張された体 volumetrical なイメージングを同時に達成することは永続的な制限事項となっており、超解像マッピングを、単なる孤立した光学切片から細胞や多細胞系全体へと拡張することを妨げている。

手法
著者らは、ツインAiryエンジニアード点広がり関数（ePSF）を二光子ライトシート蛍光顕微鏡（LSFM）に統合することで、この課題に対処している。実験セットアップは、フェムト秒パルス・ガウス照明ビーム（ビーズには860 nm、生物学的試料には790 nm）を用いて、4.7 µmの半値全幅（FWHM）厚さと150 µmのレイリー範囲を持つライトシートを形成するようにスキャンされるオープントップ・ジオメトリを利用している。

主な手法的な革新は以下の通りである：

• ツインAiry ePSF: フーリエ平面に配置された空間光変調器（SLM）が、蛍光放出を変調してツインAiry PSFを生成する。この設計により、2つの主要なAiryビームの変位からエミッターの軸方向（$z$）位置を直接推論することができ、直感的な3D局在化への経路を提供する。
• 広帯域伝搬モデリング: 多くのePSF実装が狭帯域の仮定に依存しているのに対し、著者らは生物学的蛍光体（約150 nmに及ぶ）のスペクトル幅を考慮した広帯域伝搬モデルを開発した。このモデルは、現実的な条件下での正確な局在化を保証するために、広帯域の放出特性を明示的に組み込んでいる。
• ゼロ次光の保持: SLMからのゼロ次光を（スペクトル的または空間的なフィルタリングによって除去するのではなく）保持することが、局在精度に悪影響を与えないことを本研究は示している。このアプローチは、広帯域アプリケーションでゼロ次光を排除するために必要なスペクトルフィルタリングに伴う性能低下を避け、高い光子束と空間帯域幅積を維持する。
• 最適化: ツインAiry位相マスクは、伝搬モデルと組み合わせたクラメール・ラオ下限（CRLB）解析を用いて最適化され、特定のライトシート・ジオメトリに対して5.35の最適スケール因子（$\alpha$）を得た。

主な貢献

• スケーラブルな体積イメージング: 本フレームワークは、エミッターの瞬時密度と総イメージング体積を効果的に分離することに成功した。蛍光生成を薄いライトシート内に限定することで、システムはフレームあたりのエミッター数を制限し、複雑なマルチエミッター回復アルゴリズムを必要とせずにPSFの重なりを抑制する。
• 広帯域適合性: 生物学的蛍光体の広帯域放出特性をPSFの設計とモデリングに明示的に組み込むことで、標準的な生物学的蛍光体を用いた堅牢な性能を確保し、スペクトルフィルタリングによる光子予算の損失を回避している。
• ハードウェア統合: 本研究は、収集経路にSLMを追加することで、既存のLSFMシステムへの単純な改造としてこのアプローチが実装可能であることを示しており、ライトシート顕微鏡におけるシングルエミッター局在化への移行を容易にする。

結果
システムは、蛍光ビーズファントムおよび生きた哺乳類卵細胞を用いて検証された：

• 局在精度: システムは、295 µm $\times$ 330 µmの視野と100 µmの軸方向範囲において、横方向の局在精度 $\Delta x = 19$ nm および $\Delta y = 16$ nm、軸方向の局在精度 $\Delta z = 42$ nmを達成した。
• 理論的限界: 理論的なCRLB解析は、$\Delta x = 2.72$ nm、$\Delta y = 3.28$ nm、$\Delta z = 9.54$ nmの潜在的な精度を示唆しており、これは現在の実験的性能が、ePSFの固有の性能ではなく、主に機械的振動と熱ドリフトによって制限されていることを示している。
• 生物学的応用: 本手法は、マウス卵細胞（直径約80 µm）に注入された蛍光ビーズを卵細胞の体積全体にわたって局在化させることに成功した。ビーズの局在化結果は、ファロイジン染色されたtranszonal projectionの従来のLSFM画像に重ね合わせられ、生物学的に複雑な環境において構造的コンテキストを提供する本プラットフォームの能力を実証した。
• 比較: 本アプローチは、アクセシブルなイメージング体積（数桁の増加）において、従来のePSFベースの局在顕微鏡を凌駕しつつ、同等の局在精度を維持している。また、ディープラーニングやデコンボリューションを用いて重なり合うエミッターを分離する高密度体積手法と比較して、計算負荷が低い。

意義および主張
本論文は、生物学的に関連のある体積全体にわたる局在化ベースの超解像イメージングのためのスケーラブルな戦略を確立したと主張しており、ナノスケールの精度と大規模な体積顕微鏡との間のギャップを効果的に埋めている。著者らは、エミッターの分離の負担を計算による事後処理から取得時の光学制御へとシフトさせることで、複雑なマルチエミッターフィッティングを必要とせずに、拡張された生物学的体積全体にわたるナノスケールマッピングを可能にすると主張している。

著者らは、現在の性能限界が機械的安定性に起因していると指摘している。機械的振動がない場合、システムはミリメートルスケールのイメージング体積においてサブ10 nmの局在精度を達成できると予測している。本研究は、このアプローチを、高密度な計算手法に対する補完的な選択肢として位置づけており、光学的に効率的かつ計算量的に扱いやすい3D超解像顕微鏡への道筋を提示している。