Spectral DiffuserScope: a compact snapshot hyperspectral microscope

技術要約：Spectral DiffuserScope

問題提起
ハイパースペクトル蛍光顕微鏡法は、高密度な細胞ラベル付けのための多数の蛍光体による線形アンミキシングや、マルチプレックス化されたビーズベースのバイオアッセイの識別といったタスクを可能にし、生物学的および臨床的応用において強力なツールとなります。しかし、従来のハイパースペクトルシステムは通常、3Dデータキューブを構築するために（空間的または分光的な）スキャンに依存しており、その結果、装置が大型化し、取得時間が長くなり、スループットが制限されます。これらの制限は、ハイコンテンツスクリーニングや、現代の機械学習に必要とされる大規模なデータセットの収集を妨げています。スナップショット型ハイパースペクトルイメージャーは、単一の露光で完全なデータキューブをキャプチャできますが、多くの従来のアプローチは、限定的なスペクトルチャンネル数、大きな物理的設置面積、あるいは不十分な空間・分光解像度の問題を抱えています。

手法
著者らは、標準的なベンチトップ型エピ蛍光顕微鏡に取り付け可能な、コンパクトで計算論的なスナップショット・ハイパースペクトル顕微鏡であるSpectral DiffuserScopeを提案しています。このシステムは、単一の2Dセンサー測定から高次元のハイパースペクトルデータキューブを再構成するために、圧縮センシングを採用しています。

• 光学アーキテクチャ: 本デバイスは、顕微鏡の出力ポートに配置される3つの主要コンポーネントからなるコンパクトなモジュール（約15 cm × 6 cm × 6 cm）で構成されています。
  1. 顕微鏡の対物レンズのフーリエ（瞳）面をアクセス可能な場所に結像させるリレーレンズ。
  2. リレーされたフーリエ面に配置される、カスタム設計されたディフューザー。このディフューザーは、システムの点広がり関数（PSF）を鋭いコースティック（焦絡）特性を持つように形成します。これにより、各空間点からの光を複数のスペクトルフィルターに拡散させつつ、高周波の空間詳細を保持します。
  3. モノクロCMOSセンサーと、センサーに直接貼り付けられたカスタムの64チャンネル・スペクトルフィルターアレイ（8×8のスーパピクセルで構成され、各々が64個の固有のファブリ・ペローフィルターを含む）からなるスペクトルカメラ。
• フォワードモデル: システムは、サンプルのハイパースペクトルデータキューブを、ディフューザーのPSFと畳み込み、さらにスペクトル透過行列と要素ごとに乗算したものとしてモデル化します。ディフューザーがフーリエ面に配置されているため、システムはシフト不変です。
• 再構成アルゴリズム: 逆問題は、以下のいくつかの事前知識を活用した最適化ベースのアプローチを用いて解決されます。
  • 空間的スパース性: 蛍光シーンに内在するスパース性を利用します。
  • 区分的滑らかさ: 空間次元における高周波変動にペナルティを課し、スペクトルプロファイルにおける滑らかさを強制します。
  • 低ランク/ワンホット分解: データキューブを、空間的な重みマップとスペクトルプロファイルの和としてモデル化します。「ソフト」な割り当て（ソフトマックス）を使用して、どのスペクトル成分が各ピクセルで支配的かを決定し、最適化が進むにつれて「ワンホット」な選択（各ピクセルには1つの蛍光体が存在するという仮定）へと鋭敏化させます。
  • 直交性: 学習されたスペクトル成分間の直交性を強制する損失項を設け、スペクトルの重なりを最小限に抑える蛍光体の選択という慣習を模倣します。
    アルゴリズムは、データ忠実度、空間・スペクトル的な滑らかさ、スパース性、および多様性のバランスをとる損失関数を最小化し、勾配降下法（Adamオプティマイザ）によって解かれます。

主な貢献

1. コンパクトなスナップショット設計: 標準的な顕微鏡に可動部品なしでスナップショット・ハイパペクトルイメージングを可能にするモジュール式の取り付け装置であり、フィルターホイールやスキャニングシステムと比較して取得時間を大幅に短縮します。
2. ディフューザーによる解像度の向上: フーリエ面にカスタムディフューザーを配置することで、本システムは従来のフィルターアレイ型スナップショットシステムよりも3倍高い空間解像度を実現します。ディフューザーは、高周波の空間情報を犠牲にすることなく、すべての空間位置において完全なスペクトルサンプリングを保証します。
3. オープンソースでの公開: 著者らは、導入を容易にするために、ハードウェアの部品表（BOM）、組み立て手順、および再構成ソフトウェアをオープンソースとして提供しています。
4. 性能ベンチマーク: 本システムは、シミュレーションによる代替光学構成（ダイレクトイメージング、高倍率、ぼけたPSF）および実験的なグラウンドトゥルース（真値）に対して厳密にベンチマーク評価されています。

実験結果
システムは、シミュレーションおよび様々なサンプルを用いた実験を通じて検証されました。

• 蛍光ビーズ: 本システムは2.4 µmの蛍光ビーズを解像することに成功し、サブ・スーパピクセル解像度（実験的に20 µm間隔のビーズ、すなわち0.12スーパピクセルを解像）を実証しました。
• 動的なサンプル: 蛍光ビーズを含む乾燥する水滴のビデオをキャプチャし、モーションブラーなしで粒子の動きをリアルタイムで追跡できる能力を実証しました。
• MRBLESハイドロゲルビーズ: マルチプレックス・バイオアッセイに使用されるランタノイド添加ハイドロゲルビーズを撮像しました。本システムは、固有のスペクトルコード（Europium、Dysprosium、Samarium）とその比率を正常に回収し、フルオロメーターで取得されたグラウンドトゥルースのスペクトルと一致しました。
• 生物学的細胞: CellTracker GreenおよびOrangeでラベル付けされたヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を撮像しました。本システムは、重なり合う放出スペクトルを正確にアンミキシングし、空間パターン（DNA指向性パターニングによる「CAL」形状を含む）を再構成しました。
• 解像度の限界: 理論的な解像度は約27–29 µm（0.17–0.18スーパピクセル）と算出されました。実験的な解像度は、スパースなシーンにおいてはスパース性事前知識によりこれを上回りましたが、高密度で狭帯域なシーンでは、活性化されるピクセルが不足するため困難が生じました。

意義と主張
論文は、Spectral DiffuserScopeを、生物学的および臨床的な設定における実用的な高スループット・ソリューションとして位置付けています。その主な意義は、そのコンパクトさとスナップショット機能にあり、これにより、スキャニングシステムでは不可能であった動的なサンプルのキャプチャや大規模なデータセットの取得が可能になります。

著者らは、以下のような限界についても控えめに認めています。

• 光子効率: スナップショット方式では、各波長が一部のピクセルにのみキャプチャされるため、逐次的なフィルターホイールシステムと比較して、暗いサンプルに対しては長い露光時間を必要とします。
• 信号強度: 室温のCMOSセンサーの使用およびカバーガラスの除去は、極低光量アプリケーションにおいて課題となります。
• シーン依存性: 再構成の品質は、シーンのスパース性とスペクトル帯域幅に強く依存します。高密度で狭帯域なシーンの再構成は困難です。
• 迷光: 古い顕微鏡のフィルターや反射によるアーティファクトが観察されており、将来のイテレーションにおけるより優れた光学コーティングとアライメントの必要性を示唆しています。

これらの制限にもかかわらず、著者らは、本システムが空間・分光解像度、視野、および取得速度のバランスにおいて有望な選択肢を提供し、粒子追跡からマルチプレックス・バイオアッセイに至るまでのアプリケーションにおいて実行可能なツールであると主張しています。今後の課題としては、3D再構成アルゴリズム、ディフューザーとフィルターアレイの共同最適化、および感度向上のための冷却sCMOSセンサーの使用が挙げられています。