Uterine ERBB3 signaling is critical to cultivate stromal environment for functional gland branching

技術要約：子宮のERBB3シグナル伝達は、機能的な腺分岐のための間質環境を構築するために極めて重要である

問題提起
着床前の子宮腺の分化は、広範な腺分岐を特徴とし、これは胚の着床に対する子宮の受容性を確立する白血病抑制因子（LIF）の分泌に不可避なプロセスである。転写因子FOXA2は、腺のアイデンティティおよびLIF産生に不可欠であることが知られているが、この分化が腺細胞固有のメカニズムのみによって制御されているのか、あるいは周囲の間質微小環境を介した間葉系・上皮間の相互作用によって影響を受けているのかについては、依然として不明である。これまでの研究では、腺上皮細胞内の調節因子が特定されてきたが、着床前の腺分岐およびFOXA2発現の維持を制御する間質のシグナル伝達における役割については、十分に理解されていない。

方法論
本研究では、子宮機能におけるEpidermal Growth Factor Receptor 3 (ERBB3) の役割を解明するために、遺伝子改変マウスモデル、3D組織イメージング、およびマルチオミクス・アプローチを組み合わせて用いた。

• 遺伝子モデル： 著者らは、間質および上皮の両コンパートメントで子宮特異的にErbb3を欠損させたマウス（Pgr-Creを用いたErbb3^d/d）と、上皮特異的に欠損させたマウス（Ltf-Creを用いたErbb3^epi/epi）を作製した。さらに、下流の経路を検証するために、子宮特異的にIGF1受容体を欠損させたマウス（Igf1r^f/fとPgr-Cre^+/−を交配して作製したIgf1r^d/d）を使用した。
• 表現型解析： 妊娠の結果は、膣プラグの検出およびインプランテーション部位の可視化（Chicago Blue染色）を通じて評価された。子宮腺の構造は、3Dイメージング（3DISCO組織透明化法）および共焦点顕微鏡を用いて解析し、腺分岐形態形成を定量化した。
• 分子プロファイリング：
  • 単一細胞RNAシーケンシング (scRNA-seq)： Erbb3^f/fおよびErbb3^d/dマウスの第3日目の妊娠子宮に対して実施し、細胞型特異的な転写変化および細胞間コミュニケーションネットワークを特定した。
  • バルクRNA-seq： 第3日目の子宮から単離した間質細胞に対して実施し、差発現遺伝子（DEG）および成長因子候補を確認した。
  • 再解析： 公開されているscRNA-seqデータ（GSA: CRA011266）をCellChatを用いて再解析し、リガンド・受容体相互作用をマッピングした。
• 機能アッセイ： 主要なマーカー（FOXA2, LIF, p-AKT, Igf1）のタンパク質およびmRNAレベルを評価するために、免疫蛍光染色、ウェスタンブロッティング、および定量的PCRを用いた。また、外因性のLIF投与が着床不全を救済できるかどうかをテストした。

主な結果

1. 間質ERBB3は生殖能に不可欠である： 上皮特異的なErbb3欠損（Erbb3^epi/epi）は正常な生殖能を示したが、全子宮欠損（Erbb3^d/d）は、生存産子の産出において約70%の失敗率を招いた。この不妊は、胚盤胞の欠陥ではなく、着床不全に起因していた。
2. 腺分岐の不全とFOXA2の消失： Erbb3^d/d子宮は、着床前期間（第4〜5日）において顕著な腺分岐の減少を示した。その結果、これらの腺はFOXA2およびLIFの発現が著しく減少していた。特筆すべきことに、思春期前のErbb3^d/d子宮は正常な腺形態とFOXA2発現を示しており、この欠陥は思春期後に発生し、卵巣ホルモン周期に依存していることを示唆している。
3. LIF不足は唯一の原因ではない： Erbb3^d/d子宮においてLIFレベルは低下していたが、組換えLIFの外因性投与は着床不全や脱落膜形成を救済できなかった。これは、ERBB3欠損がLIF不足を超えた、より広範な子宮受容性の欠陥を引き起こしていることを示唆している。
4. 媒介因子としての間質IGF1の同定： 第3日目の間質細胞のトランスクリプトーム解析により、Erbb3^d/dマウスにおいてIgf1の有意なダウンレギュレーションが明らかになった。公開データのCellChat解析により、間質細胞がIGF1を分泌して上皮のIGF1Rを活性化するという、一方向的なパラクリン・シグナリング軸が確認された。
5. IGF1R欠損による表現型の模倣： 子宮特異的なIgf1r欠損（Igf1r^f/f Pgr-Cre^+/−雌）は、Erbb3^d/d子宮で見られた腺分岐の欠陥を再現した。しかし、Erbb3^d/dとは異なり、Igf1r欠損はFOXA2の発現を減少させなかったことから、ERBB3は（分岐に関してはIGF1依存的、FOXA2の維持に関してはIGF1非依存的な）両方のメカニズムを通じて腺を制御していることが示唆された。
6. シグナル伝達経路： 本研究は、子宮のERBB3欠損が上皮細胞におけるAKTのリン酸化（p-AKT）の減少につながることを示し、間質ERBB3シグナルが上皮のIGF1R-AKT活性化を介して腺分岐に不可欠であることを結びつけた。

主な貢献

• 本論文は、上皮ERBB3ではなく、間質ERBB3シグナルが着床前の子宮腺分岐および機能の決定的な調節因子であることを確立した。
• 成長因子シグナルを介した特定の「間質-上皮パラクリン軸（ERBB3 → 間質IGF1 → 上皮IGF1R）」を特定した。
• 腺の分岐を制御するメカニズム（IGF1R依存的）と、腺細胞のアイデンティティ／FOXA2の維持を制御するメカニズム（ERBB3依存的、潜在的にはIGF1R非依存的）を区別した。
• 間質微小環境が、生殖周期中に腺上皮細胞の転写学的アイデンティティ（FOXA2）を維持するために不可欠であるという証拠を提供した。

意義および主張
著者らは、ERBB3がERBB3-IGF1-IGF1Rシグナル伝達経路を介して腺分岐および胚着床を制御していることを示す知見を提示している。彼らは、間質環境は単なる受動的な足場ではなく、上皮の分化とアイデンティティを駆動する能動的な調節因子であると断じている。本研究は、Erbb3^d/d雌における着床不全が多因子性であり、LIF産生の喪失と、LIFのみでは救済できないより広範な間質-上皮間のコミュニケーションの欠陥の両方に関与していることを強調している。本研究は、成長因子シグナルを介した重要な間質-上皮間のクロストークに焦点を移すことで、子宮腺の形態形成に関する理解を進展させるものである。