Label-free volumetric refractive-index imaging of fibrillar collagen architecture, assembly, and cell-associated remodeling

技術要約：線維性コラーゲンのラベルフリー・ボリューム屈折率イメージング

問題提起
線維性コラーゲンは細胞外マトリックス（ECM）の主要な荷重支持スカフォールドであり、組織の力学、構造、および細胞挙動を制御している。コラーゲンの集合とリモデリングを3次元（3D）で理解することは、生物物理学、疾患モデリング、および組織工学において極めて重要である。しかし、既存のイメージング手法には以下のような重大な限界がある：

• 蛍光顕微鏡法は、重合を乱したり、集合を変化させたり、フォトブリーチングを引き起こしたりする可能性のある外因性ラベルを必要とするため、長期的な観察を制限する。
• 二次高調波発生（SHG）顕微鏡法は内因性のコントラストを提供するが、分子の秩序と配向に依存しており、その強度は局所的なコラーゲン質量を直接示す指標にはならない。
• 散乱ベースの手法（例：共焦点反射、OCT）は、コントラストを質量に関連する繊維記述子へと変換する能力に欠けている。
• 定量的位相イメージングは、多くの場合2次元または投影された状態に留まり、ボリューム的な繊維ネットワークのスケール詳細を捉えることができない。

したがって、コラーゲンネットワークの構造を、集合およびリモデリング中の定量的かつ質量に関連した読み出し値へと結びつける、非破壊的なラベルフリー3Dイメージング手法が求められている。

手法
著者らは、再構成された線維性コラーゲンのボリュームイメージングおよび定量的プロファイリングのためのラベルフリープラットフォームとして、**ホロトモグラフィー（HT）**を提示する。

• イメージングシステム： デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）によってパターン化された450 nm LED照明を利用した低コヒーレンスHTシステム（HT-X1）。複数の照明条件下で取得された強度画像は、全変動正則化を用いた3Dデコンボリューションアルゴリズムによって、3D屈折率（RI）トモグラムへと計算によって再構成される。
• 検証： RIで解像された構造が線維性コラーゲンに対応することを確認するために、著者らはHTデータをSHG顕微鏡（二光子顕微鏡を使用）および蛍光ラベル化コラーゲンと共登録（レジストレーション）した。登録は、強度ベースのアフィン整列および手動のランドマーク識別を介して行われた。
• 定量的解析：
  • セグメンテーション： 3D RIボリュームの代表的な軸方向断面は、**カーブレット変換ベースの繊維抽出パイプライン（CT-FIRE）**を用いて処理され、個々の繊維の中心線とマスクを生成した。
  • 指標： パイプラインは、有効繊維幅、長さ、直線性、配向、およびRI由来のドライマスを定量化した。
  • 質量計算： 局所的なドライマス密度（$C$）は、RIコントラスト（$\Delta n$）を用いて、線形関係式 $C(r) = \Delta n(r) / \alpha$（ここで $\alpha$ は比屈折率増分 0.18 mL/g、$n_m$ は媒体のRI 1.3370）から導出された。繊維あたりのドライマスは、セグメント化された繊維マスク上で整流されたRIコントラストを積分することによって算出された。
• 実験条件： 本研究では、様々な濃度（一致させた0.8 mg/mLの条件を含む）におけるタイプIおよびタイプIIIコラーゲンゲル、タイプIコラーゲンのタイムラプス・フィブリルジェネシス（線維形成）、およびHT1080細胞埋入ゲルにおける薬理学的摂動（ROCK阻害剤 Y-27632 および MMP阻害剤 GM6001）を分析した。

主な結果

1. ラベルフリー・ボリュームイメージング： HTは、外因性ラベルを用いることなく、連続的な線維ネットワークを3Dで解像することに成功した。直交断面および3Dレンダリングにより、約30 µmの軸方向範囲にわたる繊維形態と深さ依存的な組織化が可視化された。
2. SHGによる検証： 共登録されたHTおよびSHGスタックは、空間的な対応を示した。RI陽性の構造は、高密度領域および低密度領域の両方においてSHG陽性の繊維と一致しており、これはHTで解像されたRI特徴が線維性コラーゲンを代表していることを裏付けている。この一致は、異なるコントラストメカニズム（局所的なRI変化 vs 非線形な分子秩序）にもかかわらず成立した。
3. サブタイプおよび濃度依存性：
   • 0.8 mg/mLにおいて、タイプIコラーゲンはより幅広く、疎に分布した繊維を形成したのに対し、タイプIIIコラーゲンはより細かく密なネットワークを形成した。
   • 平均的な繊維関連RIはサブタイプ間で同等であった（差は$10^{-4}$未満）、これは、フェノタイプ的な違いが（個々の繊維のコラーゲン密度ではなく）ネットワークの組織化（空間分布）によって駆動されていることを示している。
   • 濃度シリーズ全体を通じて、タイプIは濃度上昇に伴い繊維幅とドライマスが増加したが、タイプIIIはより微細な構造を維持した。
4. 時系列ダイナミクス：
   • フィブリルジェネシス： タイムラプスHTは、タイプIコラーゲンが弱い拡散したプレジェレーション状態から、高密度な線維性ネットワークへと移行する過程を捉えた。体積平均RIの変化（$\Delta n$）は時間の経過とともに増加し、ゲル化のキネティックな読み出し値を提供した。
   • 細胞によるマトリックスのリモデリング： HT1080細胞埋入ゲルにおいて、HTは細胞形態と周囲のコラーゲン繊維を同時に可視化した。本システムは、24〜26時間にわたり、細胞-マトリックス界面における局所的な繊維の変位、曲がり、および再編成を捉え、別個のラベルなしで細胞駆動のリモデリングを監視できることを示した。

意義および主張
本論文は、HTを、コラーゲンに富む細胞外マトリックスのボリューム可視化およびRIベースの定量化のための補完的なラベルフリーアプローチとして位置づけている。

• 物理的な解釈可能性： 分子の秩序に敏感なSHGとは異なり、HTは局所的な生体分子濃度およびドライマスに結びついた、物理的に解釈可能なコントラストメカニズム（RI）を提供する。これにより、SHGの強度では直接エンコードされない指標である、繊維に関連する質量分布の定量化が可能となる。
• 非破壊的な長期的解析： この手法は、蛍光ラベルに伴うフォトブリーチングや摂動なしに、コラーゲンの集合（フィブリルジェネシス）および細胞によるリモデリングを監視することを可能にする。
• 同時マルチコンポーネントイメージング： HTは、単一の測定において細胞と周囲のマトリックスを同時に可視化できるため、エンジニアリングされた組織や疾患モデルにおける細胞-マトリックス相互作用の研究を容易にする。
• 限界と範囲： 著者らは、RIコントラストは本質的にコラーゲン特異的ではないこと（複雑な組織における検証が必要）、および繊維解析が完全な3Dトレーシングではなく2D軸方向断面に限定されていること、さらに絶対的な質量定量は仮定されたパラメータと調製条件に依存することを控えめに述べている。したがって、報告された値は、絶対的な生物学的シグネチャというよりも、一致した条件下での堅牢な相対比較として解釈される。

要約すると、本研究は、HTが3D構造、質量に関連する定量化、およびダイナミクスを単一の非破壊的な測定において結びつけるツールであることを確立しており、定量的細胞外マトリックス生物物理学への新たな道を切り開くものである。