foxQ2 marks fast-acting interneurons including dopaminergic neurons of mushroom bodies and central complex in the beetle T. castaneum

*技術要約：foxQ2は、コクヌストキビチョウ（T. castaneum）のキノコ体および中央複合体におけるドーパミン作動性ニューロンを含む、速い作用を持つ介在ニューロンを標識する*

問題提起
昆虫の脳の発達、特に前脳における多様なニューロン型の特定は、腹神経索（VNC）と比較して理解が進んでいない。VNCのパターニングは節的な遺伝子や柱状の遺伝子によってよく特徴付けられているが、前方の脳はfoxQ2を含む一連の保存された転写因子に依存している。foxQ2II（これまでの節足動物の文献ではfoxQ2と参照される）は、胚における初期の前方神経外胚葉のパターニングおよび中央複合体（CX）の形成に極めて重要であることが知られているが、成体脳におけるその具体的な役割およびそれが標識するニューロンの正体は依然として謎のままであった。さらに、他の動物系統におけるfoxQ2遺伝子の機能的範囲は、主に感覚細胞や神経分泌細胞の特定に関連付けられてきたため、高次脳センター内の介在ニューロンの特定におけるその役割については理解の空白が存在していた。

方法論
著者らは、Drosophila（ショウジョウバエ）の脳発達研究における制限（例：幼虫期の脳の複雑性の減少）を克服するために、モデル系としてコクヌストキビチョウ（Tribolium castaneum）を利用した。本研究では多角的なアプローチを採用した：

1. トランスジェニック系統： 著者らは、Tc-foxQ2II陽性細胞がEGFPおよびCreリコンビナーゼを発現するエンハンサー・トラップ系統（foxQ2-5'-line）を使用した。
2. 免疫組織化学： EGFPと内因性Tc-FoxQ2タンパク質の重複を検証するために二重免疫染色を行った。さらに、アセチルコリン（ChAT）、グルタミン酸、GABA、セロトニン（5-HT）、ドーパミン（TH）、およびオクトパミン（TBH）の染色により、神経伝達物質の同一性を特徴付けた。
3. Brainbowシステム： 高密度にラベルされた脳における投影パターンの重複を解明するため、著者らはTribolium Brainbowシステムを確立した。EFA-Brainbow系統を作成し、それをfoxQ2-5'-lineと交配させることで、Tc-foxQ2II陽性ニューロンを膜結合型蛍光タンパク質（mCherry, mEYFP, mCerulean）を用いて疎かつ確率的にラベルすることに成功した。
4. 顕微鏡観察および再構築： 高解像度イメージングを行うために、共焦点顕微鏡およびSTED（刺激放出抑制）顕微鏡を用いた。シナプシン染色に基づいてニューロピルの境界を定義し、VVDviewerおよびAmiraソフトウェアを用いて、ニューロンの投影およびニューロピルの3D再構築を行った。
5. 比較解析： 形態および投影パターンを、確立されたDrosophila電子顕微鏡データセットおよび既知のドーパミン作作動性クラスター（PPL1, PPL2c, PPM1など）と比較した。

主な結果

• ニューロンのクラスタリング： 成体脳において、9つの明確なTc-foxQ2II陽性ニューロンクラスター（Median Cluster 1 & 2、Lateral Clusters 1–4、Posterior Clusters 1 & 2、およびTritocerebrum Cluster）を特定した。追加の前方クラスターも認められたが、内因性のfoxQ2発現を欠いていたため除外された。
• 投影パターン：
  • Median Clusters (MC1, MC2): プロトセレブラルブリッジの近傍に位置し、同側性の腹内側脳/後部斜面（VMCpo/PS）および外側副葉（LAL）へと投影される。これらはDrosophilaのPPM1ドーパミン作動性ニューロンと形態学的相同性を示す。
  • Lateral Cluster 1 (LC1): これらのニューロンはキノコ体（MB）と中央複合体（CX）の両方に投射する。サブクラスタリングにより、LC1a（MB内側葉およびCXに投射）とLC1b（中央体へ投射）に分類された。これらはDrosophilaのPPL1ドーパミン作動性ニューロンに類似している。
  • Lateral Clusters 2–4: 視葉の近傍に位置し、対側半球または特定のプロトセレブラル領域（SLP, SMP）へと投影されるが、MB/CXへの直接的な接続は持たない。
  • Posterior Clusters (PC1, PC2): VMCpo/PSおよびLALへと投影され、下降ニューロンとしての相同性を持つ可能性がある。
• 神経伝達物質の同一性：
  • すべてのTc-foxQ2II陽性ニューロンは、速い作用を持つ神経伝達物質であるアセチルコリン（ChAT）および／またはグルタミン酸を発現している。
  • Tc-foxQ2II陽性ニューロンの中に、GABA作動性またはセロトニン作動性のものは見出されなかった。
  • 有生体アミンを発現するかなりのサブセットが存在する。MC、LC1、LC2、およびLC3クラスターのニューロンの約60–90%がドーパミン作動性である。具体的には、成体の脳におけるドーパミン作動性ニューロン（視葉を除く）の**25.8%*がTc-foxQ2II*陽性である。
  • オクトパミンも一部のクラスターで検出されたが、ドーパミンよりも頻度は低かった。
• 発生学的ダイナミクス： Brainbowシステムにより、Tc-foxQ2IIの発現は一部の系統において一過性であることが明らかになった。エンハンサー・トラップ（EGFP）は成体のCXにおける接線状ニューロンを標識するが、永久的なBrainbowラベルは、Tc-foxQ2IIがCXの柱状ニューロンを生み出す胚の系統においても活性化しており、その後、成体期にはfoxQ2の発現が停止することを示した。

意義および主張
本論文は、foxQ2遺伝子の既知の機能範囲を、感覚細胞や神経分泌細胞の特定から、高次脳センターに関与する介在ニューロンの特定へと拡張することを主張している。

• 介在ニューロンの特定: 本研究は、foxQ2IIが単なる感覚細胞や神経分泌細胞ではなく、特定のクラスの速い作用を持つ介在ニューロン（コリン作動性／グルタミン酸作動性）のマーカーであることを示している。
• ドーパミン作動性サブタイプ: 著者らは、Tc-foxQ2IIが、キノコ体および中央複合体に投射する特定のドーパミン作動性ニューロンのサブタイプ（DrosophilaのPPL1, PPL2c, PPM1クラスターに相同）の組合せ的な特定に関与していると提案している。
• 高次脳センター: 本研究の結果は、Tc-foxQ2II陽性ニューロンが、学習、記憶、およびナビゲーションに重要な構造であるキノコ体および中央複合体の回路に寄与していることを確立している。
• 発生学的可塑性: 同一の転写因子が、異なる発生段階において異なるニューロン系統（柱状 vs 接線状）で活性化し得ることを強調しており、これは脳の発達における時間的に制御された役割を示唆している。

著者らは、Brainbowシステムは疎なラベル付けを提供したものの、単一ニューロンによるMBとCXの間の直接的な接続を決定的に証明するのに十分な単一細胞解像度には達しておらず、これはより高度な単一細胞標識ツールによって検証されるべき仮説として残されていると結論付けている。しかしながら、集積されたデータは、Tc-foxQ2IIが、速い作用を持つ、しばしばドーパミン作動性の特定のクラスの介在ニューロンを定義するという役割を強く支持している。