Genome-wide structural variant landscape following HDR-enhanced CRISPR editing in human hematopoietic stem and progenitor cells

技術要約：ヒト造血幹・前駆細胞におけるHDR強化型CRISPR編集後のゲノムワイドな構造変異ランドスケープ

問題提起
ヒト造血幹・前駆細胞（HSPCs）におけるCRISPR-Cas9ゲノム編集の治療的応用は、相同組換え修復（HDR）の効率が低いことにより、しばしば阻害される。これを克服するために、非相同末端結合（NHEJ）を抑制しHDRを強化する目的で、AZD7648などのDNA-PK阻害剤（DNA-PKi）が用いられる。しかし、近年の研究では、DNA-PKi処理が大規模なオンターゲット欠失や転座を含む大規模な構造変異（SV）を誘発する可能性を示唆しており、ゲノムの完全性を損なう恐れがあるという安全性への懸念が提起されている。これまでの研究でこれらのリスクは特定されているものの、SVの負担が主に編集プロセス自体によって引き起こされるのか、あるいはDNA-PK阻害によって特異的に増幅されるのかを包括的に評価し、また、これらのリスクが一次ヒトHSPCにおいてゲノム全体に及ぶのかを判断する必要がある。

方法論
著者らは、一次ヒト臍帯血由来のCD34+ HSPCにおける局所的なオンターゲットおよびグローバルな構造変異を評価するために、ロングリード・ナノポアシーケンシングとシングルセルStrand-seqを組み合わせた多変量戦略を採用した。

1. オンターゲット解析（ナノポアシーケンシング）:

   • 標的: 研究では2つの遺伝子座（SRSF2 (P95) および DNMT3A (R882)）に焦点を当てた。
   • 実験条件: 細胞は、未編集コントロール、編集のみ、編集＋AZD7648、編集＋PolQ阻害剤（PolQi2）、および編集＋AZD7648＋PolQi2の5つの条件下で編集された。
   • パイプラインの革新: ロングリードデータにおいて、切断されたリードが欠失の推定値を膨らませる問題を解決するため、著者らは新しい「バイラテラル・アンカリング（両側アンカリング）」パイプラインを開発した。この手法は、大規模な欠失（>50 bp）を定量化する前に、Cas9切断部位の両側でリードがアンカー（固定）されることを要求することで、技術的なアーティファクトを効果的に排除する。
   • 解析: パイプラインを用いて大規模欠失の頻度とサイズを定量化し、微小相同性介在型末端結合（MMEJ）のシグネチャーを評価した。編集効率はSangerシーケンシング（ICE解析）によって検証された。

2. ゲノムワイド解析（Strand-seq）:

   • ワークフロー: ノックフェクション後、HSC濃縮集団（CD34+CD45RA-CD90+）をソートし、7〜9日間拡大培養した後、シングルセルStrand-seqに供した。
   • 条件: 6つの条件を解析した：コントロール、単一遺伝子座編集（SRSF2 または DNMT3A）かつAZD7648の有無、および同時二重遺伝子座編集＋AZD7648。
   • 検出:
     • 相互転座: 相補的なリードのエビデンス、ストランド方向の一致、およびシングルセル内での位置的クラスタリングを要求することで、染色体間の相互的な再編成を検出するカスタムパイプラインを開発した。
     • SV負担: シングルセル解像度でゲノムワイドな欠失、重複、および逆位を検出するために、MosaiCatcher v2パイプラインを使用した。
   • 統計モデリング: リプリケート間の変動を考慮しながら、編集、AZD7648、PolQi2、およびドナーの性別の影響を評価するために、ベイズ混合効果モデル（比率にはベータ回帰、カウントにはポアソン分布、細胞陽性率にはベルヌーイ分布）を用いた。

主な結果

• オンターゲット大規模欠失:

  • CRISPR編集のみでは、高頻度の大規模なオンターゲット欠失が生じた。
  • AZD7648の効果: AZD7648の添加により、編集単独と比較して大規模欠失の頻度は緩やかではあるが一貫して増加したが、この効果は編集自体に起因する増加よりも大幅に小さかった。
  • PolQ阻害: PolQi2処理は、単独でもAZD7A7648との併用でも、大規模欠失率を強力に軽減した。これは、PolQ依存的なシータ媒介末端結合（TMEJ）が、これらの条件下での大規模欠失の主要な駆動因子であることを裏付けている。
  • メカニズム: MMEJのシグネチャーは無視できる程度であり、観察された欠失は古典的なMMEJではなく、TMEJによって駆動されていることを示している。
  • 欠失サイズ: 実験条件は欠失を含むリードの「頻度」を変化させたが、欠失の典型的な「サイズ」を有意に変化させることはなかった。

• ゲノムワイド構造変異（Strand-seq）:

  • SV負担: いずれかの遺伝子座での編集は、ゲノム全体における大規模な欠失、重複、および逆位の負担を高めた。この増加は、AZD7648による特異的な影響ではなく、編集行為全般によって引き起こされた。AZD7648は、大規模な欠失・重複の負担に対する追加の影響を示す証拠をほとんど示さなかった。
  • 相互転座: 転座は低頻度で検出された。同時二重遺伝子座編集は、単一編集と比較して、転座率を相加的に増加させた。驚くべきことに、AZD7648は転座率を増加させず、むしろAZD7648処理された細胞では編集単独の場合と比較して頻度が減少する傾向が見られた。
  • クロマチン環境: SVイベントは主にユークロマチン領域に濃縮されており、これはランダムに分布しているのではなく、Cas9のアクセシビリティおよび脆弱部位の分布と一致している。
  • 姉妹染色分体交換（SCE）: SCEの頻度に有意な変化は見られず、編集プロセスが持続的なゲノムワイドの複製ストレスを誘発しないことが示唆された。

• 相関関係:

  • 大規模欠失およびSVsの頻度は、HDR統合効率とは相関しなかった。これは、SV形成が、成功した統合率の副産物ではなく、修復経路のコンテキストに依存した独立した結果であることを示している。

意義および主張
本論文は、HDR強化型CRISPR編集における大規模なゲノム改変のリスクは、DNA-PK阻害の特異的かつ支配的な結果ではなく、Cas9による二本鎖切断およびそれに続く修復プロセスに固有のものであると主張している。

• 主要な知見: 大規模なオンターゲット欠失は、HSPCにおけるCas9誘導型修復の一般的な特徴である。AZD7648は緩やかな増分リスクを加えるものの、編集単独によるベースラインのリスクが主要な懸念事項である。
• 軽減戦略: 本研究は、HDR効率を損なうことなくオンターゲット大規模欠失を軽減するための実用的かつ効果的な戦略として、PolQ阻害を支持している。
• 安全性評価: 著者らは、DNA-PK阻害剤を使用するかどうかにかかわらず、あらゆる治療用細胞製品にとって包括的なゲノム評価が不可欠であることを強調している。彼らは、SVは検出可能であるが、多くのイベントは単一の細胞に特有のものであり、標準的なシーケンシングでは見逃される可能性があることを指摘しており、クローン増殖の機能的評価の重要性を述べている。
• 転座ダイナミクス: 先行研究の報告とは異なり、本研究は、AZD7648が修復の結果を相互転座から大規模欠失へとシフトさせる可能性があることを示唆している。ただし、転座の総負担は依然として低く、主に同時発生する切断の数によって駆動されている。

結論として、本研究は、一次HSPCにおけるSVの厳密なシングルセル解像度のランドスケープを提供し、DNA-PK阻害には注意深いモニタリングが必要であるものの、根本的な安全性の課題は編集プロセスそのものにあり、広範なゲノム監視とPolQ阻害のような軽減戦略の採用が必要であることを論じている。