Benchmarking Nanopore Sequencing for Autosomal and Y-STR profiling on R10.4.1 Flowcells across Basecalling Models

技術要約：R10.4.1 フローセルを用いた常染色体およびY-STR プロファイリングのためのナノポア・シーケンシングのベンチマーク

問題提起
短反復配列（STR）プロファイリングは、伝統的にキャピラリー電気泳動（CE）に依存しており、法医学的なDNA解析の礎石であり続けている。CEは堅牢ではあるものの、固有の限界に直面している。すなわち、スペクトル分解能の制限がマルチプレックス能力を制約すること、および断片長の分離に依存していることが、分解試料の解析や、長さは同じだが内部配列が異なるアイソアレルの解像度を妨げる要因となっている。次世代シーケンシング（NGS）は、塩基配列を直接決定することで解決策を提示しているが、高コストと専門的なトレーニングが必要であることから、フィールドや法医学研究室への導入は限定的であった。Oxford Nanopore Technologies（ONT）は、ポータブルでコスト効率の高い代替案を提示しているが、歴史的に法医学への応用は、STR遺伝子座に多く見られるホモポリマー領域における高い生データリードのエラー率によって阻まれてきた。近年のハードウェア（R10.4.1 フローセル）およびソフトウェア（高度なベースコーリングモデル）の改善が導入されているものの、法医学的STRジェノタイピングのためのこれら両者の統合的な性能を評価する包括的なベンチマーク研究は不足していた。

方法論
本研究では、単一ソースのコントロールDNAサンプル（Promega 2800M、Control DNA 007、およびNIST C）を用い、45のSTR遺伝子座（常染色体22、Y-STR 23）のプロファイリングに対するONTシーケンシングの性能を評価した。

• 実験セットアップ: サンプルはPowerSeq46GYキットを用いて増幅され、MinION R10.4.1 フローセル（二次実験ではFlongle R10.4.1）およびSQK-NBD114.24 リゲーションシーケンシングキットを用いてシーケンシングされた。
• ベースコーリングの評価: 生のPOD5ファイルは、ジェノタイピングの精度への影響を評価するために、複数のベースコーリング・ティアおよびイテレーションを用いて処理された。テストされたモデルは以下の通りである：
  • HAC (High Accuracy): バージョン 4.2, 5.0, 5.2, 6.0
  • SUP (Super Accuracy): バージョン 4.2, 5.0, 5.2
  • HYP (Hyper): バージョン 5.0 (ベータリリース)
• バイオインフォマティクス・パイプライン: 著者らは、生のPOD5ファイルをSTRプロファイルへと変換するために設計された、ユーザーフレンドリーで並列化されたパイプラインである MaSTRspy（GitHubリポジトリおよびCondaパッケージとして利用可能）を導入した。ワークフローは以下の通りである：
  1. Dorado v1.0.2を用いたベースコーリングおよびデマルチプレクシング。
  2. 最小Qスコア10（およびHYPv5.0用の特定のQ20フィルタ）によるリードのフィルタリング。
  3. Minimap2 v2.24を用いたGRCh38参照ゲノムへのマッピング。
  4. NISTおよびHoogenboomのデータセットから検証されたアレル配列のキュレートされたデータベースに対するジェノタイピング。
  5. Rベースのマルチパネルプロットによるリード深度およびアレルコールの可視化。
• 指標: ジェノタイピングの精度は、正規化閾値（>0.4, >0.35, >0.3）に対する参照プロファイルとの一致率を通じて評価された。「ノイズ」は、誤ったアレルにマッピングされたリード（スタッターを含む）と定義され、特定の遺伝子座におけるスタッターパーセンテージが算出された。

主な貢献

1. R10.4.1およびベースコーリング・イテレーションのベンチマーク: 本研究は、最新のR10.4.1ケミストリーにおける、連続的なベースコーリングモデル（HACからHYPまで）および品質フィルタリング（Q10対Q20）が、STRジェノタイピングの精度にどのように影響するかについての体系的な評価を提供する。
2. MaSTRspy パイプライン: 法医学的STRのためのナノポアデータ解析を簡素化し、遺伝子座固有の閾値やグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）を備えた専門的なツールであるMaSTRspyの開発とリリース。
3. 品質フィルタリングの分析: 高いQスコアフィルタ（Q20）を適用することのトレードオフに関する調査。これにより、リード深度を犠牲にしつつも、大幅なノイズ低減が可能であることを示した。

結果

• 段階的な精度向上: ジェノタイピングの精度は、各ベースコーリングのイテレーションとともに段階的に向上した。最新のモデルは、HYPv5.0モデルを使用した場合、常染色体STRにおいて99.0%の一致率、Y-STRにおいて100%の一致率（正規化なしでトップアレルをコールした場合）を達成した。
• ノイズ低減: Q20品質スコアによるフィルタリングは、バックグラウンドノイズを大幅に減少させた。具体的には、HYPv5.0 Q20フィルタは、全遺伝子座において、以前のモデルと比較して平均53.2%のミスアライメントリードの減少をもたらした。例えば、D18S51遺伝子座において、平均ノイズ分率はHACv5.2 Q10の約53%から、HYPv5.0 Q20の26.5%へと低下した。
• 遺伝子座別の性能:
  • 常染色体: D18S51、FGA、D22S1045などの遺伝子座は、Q20フィルタリングによる最も顕著な改善を示した。しかし、Q20フィルタリングは、リード深度の減少により、低カバレッジの遺伝子座（例：D22S1045、TH01）において、時としてアレル脱落を引き起こした。ただし、一致率はより低い正規化閾値（>0.3）において回復した。
  • Y-STR: HYPv5.0 Q20フィルタは、平均スタッター分率を20%減少させた。DYS481遺伝子座（CTT三塩基リピート）は、すべてのモデルにおいて一貫して最も高いノイズおよびスタッター分率を示した。
• Flongleの性能: Flongleフローセルでのシーケンシングは、MinIONと比較して低い一致率（>0.4の閾値で常染色体87.4%、Y-STR 93.9%）を示し、いくつかの遺伝子座で不一致が認められた。
• 問題のある遺伝子座: 特定のリピート構造（AGAAまたはCTT）または増幅因子（PENTAEにおけるアレル不均衡）に起因して、D18S51、FGA、DYS481などの特定の遺伝子座では、すべてのベースコーラーにおいて高いノイズが見られた。

意義および主張
本論文は、R10.4.1ケミストリーとベースコーリングモデルにおける継続的なバイオインフォマティクスの改善（特にSUPおよびHYPティア）の組み合わせにより、単一ソースのサンプルに対して正確なSTRプロファイルを提供することが可能であり、これはナノポア・シーケンシングにおける歴史的な障壁であった高いエラー率の問題を解決できると主張している。本研究は、適切なベースコーリングと品質フィルタリングを用いることで、ナノポア・シーケンシングが単一ソースのコントロールに対して従来のメソッドに匹敵する一致率を達成できることを示している。

しかし、著者らは実用的な準備状況については慎重な姿勢を維持している。彼らは、単一ソースの結果は有望であるものの、劣化した、あるいは低テンプレート、または複雑な混合物を含む法医学的なルーチンワークには依然として大きな障害が残っていると指摘している。本研究は、これらの知見がより多様なサンプルタイプを用いた大規模なバリデーション研究を必要としていることを示唆しており、将来のワークフローは、Qスコアフィルタリングとリード深度の要件とのバランスを取り、また、高精度なベースコーリングに必要な計算インフラ（GPU）を考慮する必要があると結論付けている。また、著者らは、ソフトウェアのアップデートがリリースされるたびに頻繁なウェットラボの再バリデーションを行う必要性を軽減するために、生のPOD5ファイルを新しいモデルで再処理できる「再解析」ワークフローを提案している。