CRISPR-Cas9 Induced Knockout of BEL5 in Tetraploid Potato: Optimized Methodology via Repeated de novo Regeneration and Impact on Tuberization

技術要約：テトラプロイド（四倍体）ジャガイモにおけるCRISPR-Cas9によるBEL5のノックアウト

問題提起
栽培種ジャガイモ（Solanum tuberosum ssp. tuberosum）におけるCRISPR-Cas9ゲノム編集の適用は、そのテトラプロイド（四倍体）かつ高度にヘテロ接合的なゲノム、および栄養繁殖という特性により、大きな障壁に直面している。標的遺伝子の全4アレルを完全にノックアウトすることは、標準的な形質転換ではモザイク現象（一部の細胞やアレルのみが編集される状態）や、アレル間での不完全な編集が生じやすいため困難である。さらに、多くの商業品種においてハプロタイプ解明された全ゲノムデータが不足していることは、オフターゲット効果を最小限に抑えつつ、すべてのレリルを標的とするガイドRNA（gRNA）の設計を複雑にしている。加えて、多倍体における変異の信頼性の高い検出は、表現型の変化が微細であるか、あるいは存在しない場合に特に困難であり、堅牢な分子学的検証戦略を必要とする。

方法論
著者らは、テトラプロイド品種「Désirée」（および「Otava」での試行）において、BEL5遺伝子の完全なノックアウトを実現するための最適化されたワークフローを開発した。その手法は以下の主要なステップで構成される。

1. ゲノム特性解析とgRNA設計： 完全なアセンブリが存在しない「Désirée」については、未アセンブリのIlluminaショートリードデータをリファレンスBEL5配列にマッピングすることで、4つのBEL5アレルを再構築した。これらの再構築は、ロングリードのOxford Nanoporeシーケンシングを用いて検証された。2つのgRNAを第1および第4エキソンを標的として設計し、全アレルをカバーするようにした。初期スクリーニングには、標的配列内の制限酵素部位を活用した。
2. 形質転換と再生： 本研究では、葉の組織片を用いたAgrobacterium法による形質転換と、それに続くde novo器官形成を利用した。T0世代のモザイク現象や不完全な編集の限界を克服するため、著者らは繰り返しのde novo再生戦略を採用した。葉の組織片を、選択されたT0植物から再び組織培養に供した。このアプローチは、脱分化に伴う動的なクロマチン再構成およびエピジェネティックな再プログラミングを利用して、標的部位へのアクセシビリティを高め、未編集のアレルに新たな変異を誘導することを目的とした。
3. 変異検出と検証： 多層的なスクリーニングアプローチを用いた：
   • CAPS解析： 切断増幅多型配列（CAPS）解析を用い、PCR産物の制限酵素部位の破壊を検出することで、迅速な初期スクリーニングを行った。
   • サンガーシーケンシングおよびTIDE： アンプリコンをシーケンシングし、Tracking of Indels by DEcomposition（TIDE）ソフトウェアを用いて、編集効率の推定およびフレームシフトの特定を行った。
   • Nanoporeアンプリコンシーケンシング： 最終検証として、BEL5遺伝子全体および隣接するUTRをOxford Nanopore技術を用いてシーケンシングした。この高深度シーケンシングにより、アレル解明された解析、大きな挿入・欠失の検出、および他の手法では検出を逃れる可能性のある微量な未編集アレルの特定が可能となった。
4. 表現型解析： 完全なノックアウト系統を、短日（誘導条件）条件下では水耕栽培システムで、長日条件下では土壌中で栽培し、塊茎形成の開始時期のモニタリング、および総収量の評価を行った。

主な結果

• 編集効率： 初期のT0世代では混合的な編集が見られ、ほとんどの系統が編集されたアレルと未編集のアレルの組み合わせを含んでいた。しかし、繰り返しのde novo再生戦略によって結果が大幅に改善された。T1世代（T0系統60の末裔）において、著者らは5つの系統（60-4, 60-5, 60-25, 60-28, 60-37）が完全に編集されているように見えることを確認した。
• 新規変異： 二度目の再生プロセスにより、T0親株において以前は未編集であったアレルにおけるde novo変異の出現が促進された。一つの系統（60-37）では、一つのアレルに極めて微量の未編集配列が残存していることが判明しており、これは完全な確認のためのディープシーケンシングの必要性を強調している。
• モザイク現象： 再生された系統における連続する6枚の葉の解析により、顕著なセクター状のモザイク現象は見られず、再生プロセスが遺伝的背景を効果的に均一化したことが示唆された。
• 表現型的影響： BEL5ノックアウト植物は、短日条件下において、野生型と比較して塊茎形成の開始が遅延した。しかし、生育期間の終了時には、変異体は野生型と同等の総塊茎収量を生産した。ノックアウトは塊茎形成を完全に阻止するものではなく、また全植物体のバイオマスを著しく変化させることもなかった。
• 遺伝子型の特異性： 本研究では、「Otava」品種は本プロトコルによる再生が困難であり、編集が検出されない形質転換系統が1つのみ得られたことが記されており、形質転換効率の遺伝子型依存性を浮き彫りにしている。

意義と主張
本論文は、ヘテロ接合性とモザイク現象の課題に対処しつつ、テトラプロイド（四倍体）作物においてCRISPR-Cas9による完全な遺伝子ノックアウトを実現するための方法論的枠組みを提供すると主張している。著者らは、繰り返しのde novo再生が、未編集のアレルにおける新たな変異の出現を促進する重要な戦略であり、それによって性的分離を必要とせずに完全な編集系統の生成を容易にすると提案している。

機能面では、本研究は現代の栽培ジャガイモにおけるBEL5の役割について新たな知見を提供している。他の遺伝子型における先行研究ではBEL5が塊茎形成の主要な正の調節因子であることが示唆されていたが、本研究は、テトラプロイドの「Désirée」において、BEL5は塊茎の発達には必須ではないものの、塊茎形成のタイミングを制御する役割を担っていることを示している。この結果は、栽培ジャガイモの塊茎形成ネットワークが強固であり、BEL5の喪失に対して、SP6Aなどの他のシグナルを介した冗長な経路を通じて補完可能であることを示唆している。

著者らは、完全なノックアウトを検証するためには高解像度のシーケンシング（Nanoporeなど）を用いることの重要性を強調している。これは、標準的なサンガーシーケンシングやCAPS解析では、低頻度の未編集アレルを見逃す可能性があるためである。結論として、BEL5は塊茎形成のタイミングに影響を与えるものの、その欠損が現代のジャガイモ品種における成功的な塊茎形成を妨げるものではないとしている。