Endomicroscopic fluorescence lifetime imaging enables molecular detection and targeted sampling in the distal human lung

技術要約：遠位肺における分子検出のための内視鏡的蛍光寿命イメージング

問題提起
ヒトの遠位肺における感染および炎症の正確な分子特性評価は、特に重症患者や人工呼吸器装着患者において、依然として重大な臨床的課題である。現在の診断ワークフローは、放射線学的イメージングに依存していることが多いが、これは特異性に欠けることが多く、また標準的な微生物学的サンプリング（例：気管支肺胞洗浄）は、結果の遅延、不完全な感度、および特定の肺胞領域を標的にできないといった問題を抱えている。これらの限界は、診断の不確ability（不確実性）、治療最適化の遅れ、および広域スペクトル抗菌薬の過剰使用を招いている。光学内視鏡（OEM）は、内因性自発蛍光を用いて肺胞微細構造を可視化する実現可能性を示してきたが、その臨床的有用性は、分子特異性の欠如、および病原体や免疫活性化をその場で直接特定するためのマルチプレックス（多項目同時検出）生物学的信号の提示能力の欠如によって制約されている。

方法論
本研究では、遠位肺におけるリアルタイムの分子イメージングと標的サンプリングを可能にするため、3つの補完的な技術を統合したプレクリニカル・プラットフォームを評価した：

1. eFLIMプラットフォーム： 臨床応用可能な内視鏡的蛍光寿命イメージング顕微鏡（eFLIM）システム（KronoScan）を使用した。このシステムは、時間分解分光計と共焦点レーザー走査顕微鏡を組み合わせており、約3フレーム/秒で蛍光強度と寿命の画像シーケンスを同時に取得できる。
2. 分子標的型スマートプローブ（SmartProbes）： 特定の生物学的標的に対して選択的に信号を生成する、3種類のウォッシュフリー（洗浄不要）蛍光プローブを用いた：
   • NBD-PMX： グラム陰性菌（大腸菌：Escherichia coli）の検出用。
   • Merocy-Van： グラム陽性菌（黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus）の検出用。
   • 好中球活性化プローブ（NAP）： 好中球活性化の主要な特徴を報告するため。
3. 多機能カテーテル（EoT）： 生体適合性に優れた使い捨てカテーテル（「Eyes on Target（EoT）」、直径1.9 mm）を開発した。これは、カテーテル壁内にイメージング用ファイバー束と1.2 mmのワーキングチャンネルを統合した設計である。この設計により、カテーテルを取り外すことなく、スマートプローブの注入、リアルタイムイメージング、および特定の解剖学的領域からの標的化された肺胞マイクロラバージュ（吸引）を同時に行うことが可能となる。

実験モデル
本プラットフォームは以下のモデルを用いて検証された：

• in vitro モデル： 細菌培養物および単離・活性化された好中球の共焦点顕微鏡観察。
• 組織ディッシュ（Tissue-in-a-dish）： スマートプローブおよび免疫細胞をインキュベートしたヒト肺組織スライス。
• ex vivo ヒト肺モデル： 移植には不適と判断された、人工呼吸器装着された全肺。細菌およびスマートプローブは、気管支鏡を介して特定の肺葉に注入された。EoTカテーテルを遠位気道へとナビゲートし、イメージングおよびその後の指向性ラバージュを実施した。

主な結果

• ナビゲーションとイメージング： EoTカテーテルは、ファントムおよび換気されたヒト肺モデルの両方において、肺胞領域へのナビゲーションに成功した。eFLIMは、内因性自発蛍光に基づいて肺胞微細解剖を明確に描き出し、経気管的に肺胞空間へ通過したことを確認した。
• 好中球の検出： NAPでラベル付けされた活性化好中球は、背景組織と比較して、明確な蛍光強度および減少した蛍光寿命のシグネチャを示した。自動検出アルゴリズムにより、プローブ投与後にNAP陽性のフレームが有意に増加することが特定された（1.0%のベースラインに対し、9.6%、p = 0.03）。
• グラム陰性菌の検出： NBD-PMXでラベル付けされた大腸菌（E. coli）は、特徴的な一過性の「ブリンキング（明滅）」蛍光強度シグネチャを示した。寿命値は背景と区別できなかったが、このブリンキングパターンによって検出が可能であった。大腸菌を注入した肺葉では、コントロールと比較してこれらのシグネチャを含むフレームの割合が有意に高かった（61.7% vs. 33.3%、p = 0.001）。
• グラム陽性菌の検出： Merocy-Vanは組織に対して非特異的な強度シグナルを示したが、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対しては明確な蛍光寿命シグネチャを提供した。≥1.9 nsの寿命閾値を用いることで、S. aureus陽性のフレームを効果的に分類し、高い特異性でコントロールと区別した（感染領域では約60%の陽性フレームに対し、コントロールでは<20%、p < 0.05）。
• 標的サンプリング： EoTカテーテルは、画像化された領域から細胞材料および細菌DNAを回収する、指向性肺胞マイクロラバージュを可能にした。qPCR解析により、広範なダイナミックレンジ（10⁴ ～ ≥10⁷ コピー/mL）にわたって細菌DNAが検出された。培養量（CFU/mL）とqPCR負荷との間に正の相関が観察された（R² = 0.415、p < 0.0001）。

意義および主張
著者らは、本研究がトランスレーショナルな分子イメージング・アプローチのプレクリニカルな検証を提供すると主張している。eFLIMとスマートプローブ、およびEoTカテーテルの統合により、以下が可能となる：

1. リアルタイムの分子イメージング： 活性化された好中球、グラム陰性菌、およびグラム陽性菌の、ヒト遠位肺内における可視化。
2. マルチプレックス検出： 蛍光寿命を利用することで、強度ベースのイメージングでは重なり合う可能性のある信号（例：NAPとNBD-PMXの信号）を分離・識別すること。
3. 空間的に一致したサンプリング： 分子イメージング信号と、全く同じ肺胞領域からのダウンストリームの微生物学的および細胞学的解析との相関を可能にすること。

本論文は、本プラットフォームが、リアルタイムで遠位肺内の感染および炎症を特性評価することにより、大きな未充足のニーズ（アンメット・メディカル・ニーズ）に対処していると結論付けている。これは、肺疾患に対する分子イメージングプローブおよび治療法の将来的な臨床開発を支持するものである。著者らは、現在のルールベースのアルゴリズムは概念実証（プルーフ・オブ・コンセプト）を提供するものであるが、今後の研究では、動きによるアーチファクトに対する堅牢性を向上させるために機械学習の統合に焦点を当てる予定であると述べている。