A platform for automated training of mammalian cell physiology

技術要約：哺乳類細胞の生理機能の自動訓練のためのプラットフォーム

問題提起
哺乳類細胞の生理機能を制御することは、細胞の複雑性と、介入に対してリアルタイムで適応する細胞の能力（薬物耐性やトランスジーン・サイレンシングなどの現象につながる）により、依然として大きな課題となっている。証拠によれば、細胞は行動科学で見られる古典的な学習形態（例：慣化、感作、連合条件付け）に類似した適応能力を備えていることが示唆されている。しかし、この分野には、これらを体系的に調査するための適切なプラットフォームが欠けている。既存のシステムは、単一の刺激様式（例：Stentorに対する機械的なタッピング）に限定されているか、あるいは単一の非神経細胞ではなく神経ネットワーク向けに設計されている（例：マイクロ電極アレイ）、または手動での薬物投与に依存しており、スケーラビリティに欠けている。したがって、細胞の学習と記憶を探索するために、タイミングを合わせた化学的刺激の提供と生理学的応答のリアルタイムモニタリングが可能な、自動化されたクローズドループ・システムへの切実なニーズが存在する。

方法論
著者らは、非神経性の哺乳類細胞に対して訓練実験を行うために設計された、オープンアクセスかつ自動化されたプラットフォームである「Cell Trainer」を提示している。本システムは主に以下の3つのコンポーネントで構成されている。

1. ハードウェア:

   • 流体制御（Fluidics）: 37°C、5% CO₂インキュベーター内に設置されたCellASIC® ONIX2マイクロ流体システム。空気圧駆動によるフローを利用して、1つのチャンバーあたり最大4つの異なる培地リザーバーを切り替え、精密にタイミングを合わせた薬物パルスを投与できる。
   • イメージング: 電動翻訳ステージ（Zaber）に搭載されたカスタムメイドの移動式蛍光顕微鏡。規定の座標間を移動して複数のチャンバーをイメージングし、Nikon 10倍対物レンズとBaslerカメラを用いて、明視野および蛍光画像（青、緑、赤の励起チャネル）をキャプチャする。
   • 環境: 電子機器を保護するため、流体および光学セットアップ全体は非加湿インキュベーター内に収容されている。蒸発を防ぐためにCellASIC®のリッドを使用している。

2. ソフトウェアおよび制御:

   • オープンループ（フィードフォワード）: システムは、静的なスクリプトに従って流体制御が培地を切り替える間、顕微鏡が一定の間隔で細胞をイメージングするという、事前定義されたスケジュールを実行する。
   • クローズドループ（フィードバック）: 追加のコントローラープロセスが並行して実行され、最新の画像を解析して細胞の挙動（例：平均蛍光強度）を判断する。制御ポリシーに基づき、画像の取得から1秒未満で、適切な状態（例：蛍光が閾値を超えた場合に酸性パルスを投与する）へと流体制御を動的に切り替える。

3. 画像解析パイプライン:

   • カスタムのPythonベースのパイプラインが時系列画像を処理する。Cellposeを用いて細胞セグメンテーションを行い（動かない細胞には静的なマスクを適用し、動く細胞には追跡を行う）、背景アーチファクトの推定と減算を行い、光学的な不完全性や培地の蛍光変化を補正するための多項式近似を行う。
   • 蛍光トレースは $\Delta F/F_0$ を用いて正規化される。
   • ダウンストリーム解析には、細胞ペア間のピアソン相関係数、主成分分析（PCA）、および学習行動（慣化、感作、および予期スコア）のための特定の指標が含まれる。

主な結果
著者らは、2つの異なる実験パラダイムを通じてプラットフォームの妥当性を検証した。

1. フィードフォード実験（感作様ダイナミクス）:

   • セットアップ: GCaMP6fを発現するC2C12筋芽細胞およびPC-3前立腺癌細胞に対し、5% DMSOの2分間のパルスを繰り返し与えた。
   • 知見: システムは個々の細胞における離散的なカルシウムスパイクの追跡に成功した。解析の結果、応答の大きさ（ピーク高）は、その後の刺激列にわたって増加する傾向があり、これは感作と一致するパターンであった。
   • 不均一性: プラットフォームは細胞型特有の違いを解明した。C2C12細胞は「ノッチ状」の応答ピークと高いベースラインノイズを示したのに対し、PC-3細胞は丸みを帯びたピークと低いノイズを示した。
   • 学習指標: 統計解析により、感作スコアにおいてヌル分布からの有意な偏差が示された。興味深いことに、細胞は「予期」行動（存在しない6回目のパルスに対する期待時刻での蛍光偏差）を示したが、その効果の方向は第1の刺激列と第2の刺激列の間で異なっていた。

2. フィードバック制御実験（生理学的ステアリング）:

   • セットアップ: pH/電圧レポーターArcLightを発現するNRK-49F腎細胞をリアルタイムで制御した。
   • 知見: システムは、蛍光が閾値を超えた際に30秒間の酸性培地のパルスを投与することで、平均細胞蛍光を一定のセットポイント以下に維持することに成功した。コントローラーは1秒未満で応答した。
   • 単一細胞解像度: 集団レベルの制御下においても、システムは個々の細胞の挙動を解明し、酸曝露により死亡したサブポピュレーションを特定し、細胞応答における空間的な相関を分析した。

主要な貢献

• プラットフォーム開発: 非神経細胞の訓練実験（オープンループおよびクローズドループの両方）が可能な、完全に自動化されたオープンソースのハードウェアおよびソフトウェアシステムである「Cell Trainer」の構築。
• オープンサイエンス: 研究コミュニティにおける細胞学習の研究を加速させるため、回路図、制御ソフトウェア、および画像解析パイプラインのすべてを公開する。
• 方法論的枠組み: 単一細胞の不均一性を定量化し、非神経細胞に対して行動科学の指標（慣化、感作、予期）を適用するための体系的なパイプラインを実証した。
• 実証的証拠: 哺乳類細胞が感作様のダイナミクスを示し、リアルタイムのフィードバック制御を通じて生理学的にステアリング可能であることを示す予備的なデータ。

意義と主張
本論文は、Cell Trainerを「細胞訓練」という新たな分野の基礎となるツールとして位置づけている。著者らは、このプラットフォームが、ボトムアップ的な分子再編から、経験と刺激を通じたトップダウン的な細胞生理機能の制御への転換を可能にすると主張している。細胞の持つ本来の適応能力を活用することで、このアプローチは、基礎的な遺伝ネットワークを微細に管理することなく、細胞の挙動を形成するための潜在的な「ユーザーインターフェース」を提供する。

著者らは、生物学的な知見については、感作様の傾向が観察されたものの、学習メカニズムを確定し、累積的な損傷などの代替的な説明を排除するためにはさらなる厳密な検証が必要であるとして、控えめに「予備的」なものと述べている。しかし、哺乳類細胞におけるクローズドループ制御と単一細胞解析が可能であることは、以下の領域に新たな道を開くと彼らは主張している。

• 治療法: 疾患細胞（癌細胞や糖尿病細胞など）を、経験を通じて健康な状態へとステアリングする可能性。
• バイオ製造: 遺伝子改変ではなく、刺激を通じてバイオリアクター内の細胞ドリフトを制御すること。
• 基礎科学: 非神経系における学習と記憶の進化論的なルーツを調査し、細胞ネットワークの計算能力を探求すること。

本研究は、多様なインテリジェンス、ロボット科学、およびAIの融合であり、刺激による生理学的経験を通じて生物学的システムを制御するという新しいパラダイムを確立することを目指している。