Reciprocal control of the stomach and intestine by viscerosensory neurons in caudal brainstem

技術要約：延髄尾側部における内臓感覚ニューロンによる胃と腸の相反的制御

問題提起
胃腸の機能は、複数の臓器にわたる運動の精密な協調に依存しており、このプロセスは、迷走神経を介した脳幹からのトップダウンの調節と、腸管固有の回路との相互作用によって制御されている。「腸のブレーキ」として知られる、遠位部の栄養素の存在が近位部の胃排出を抑制する反射は確立されているが、自然な摂食中にこれらの反射を媒介する脳内の具体的な神経基盤については、依然として不明な点が多い。これまでの研究は、主に2つの技術的な障壁によって制限されてきた。一つは、覚醒して行動している動物において、延髄孤束核（cNTS）のニューロンを記録することが困難であったこと、もう一つは、生体内（in vivo）における食物の腸管内流動を高解像度かつリアルタイムで可視化する方法が欠如していたことである。その結果、脳がいかにして食物の動的な推移を表現しているのか、また、消化のペースを整えるために脳がいかにして胃と腸の間の相反的な制御を調整しているのかについては、未解明のままである。

方法論
著者らは、覚醒・頭部固定マウスを用い、リアルタイムX線透視法、カルシウムイメージング、およびオプトジェネティクス（光遺伝学）を組み合わせた多角的なアプローチを採用した。

1. X線透視法： マウスに胃内（IG）カテーテルを装着し、バリウムを含む栄養混合液を注入した。カスタム設計の低エネルギー透視装置を用いて毎秒30フレームの速度で胃腸のダイナクスを捕捉し、Segment Anything Model 2 (SAM2) を用いて、器官の負荷（胃、近位十二指腸、遠位小腸）のセグメンテーションと定量化を行った。
2. 神経イメージングとクラスタリング： 著者らは、cNTSのグルタミン酸作動性ニューロン（Vglut2）の単一細胞カルシウムイメージングデータを再解析し、新たに覚醒マウスでのファイバーフォトメトリー記録を行った。活動に基づくクラスタリングを利用して、十二指腸の充満に伴う脈動的な性質を反映するニューロンサブポピレーションを特定した。
3. 遺伝学的同定： 十二指腸のダイナミクスを追跡する特定のニューロン集団の遺伝的マーカーを特定するため、Allen Brain AtlasのMERFISHデータを解析した。その結果、subpostrema（後区と孤束核の境界領域）に位置するグルタミン酸作動細胞クラスターの特異的マーカーとして、Neuropeptide FF (NPFF) を同定した。これにより、これらの細胞への遺伝的アクセスを可能にする Npff-2A-Cre ノックインマウス系統を作製した。
4. 機能的操作： オプトジェネティクス（ChR2）およびケモジェネティクス（hM4Di）を用い、NPFFニューロンを刺激または抑制しながら、透視法、筋電図（EMG）、および摂食行動アッセイを通じて胃腸の運動を同時にモニタリングした。
5. 回路の解剖： 作用機序を決定するために、Fosマッピングを行って下流の標的を特定し、末梢投与されたムスカリン性アセチルコリン受容体拮抗薬（メチラトロピンおよびダリフェナシン）を用いて、摂食抑制におけるコリン作動性シグナルの役割を検証した。

主な結果

1. 脈動的な胃腸ダイナクス： X線透視法により、胃から近位十二指腸への排出は連続的な流れではなく、休止を挟んだ離散的なパルスとして起こることが明らかになった。これらのパルスにより、次のボラス（塊）が到着する前に近位十二指腸が空になることが可能となり、パルスの間隔（IPI）の中央値は約2.3分であった。
2. NPFFニューロンによる十二指腸充満の追跡： NPFFの発現によって定義される特定のcNTSニューロンサブポピレーションは、これらの脈動的な十二指腸充満イベントと密接に一致するカルシウムダイナミクスを示す。同時透視法とフォトメトリーにより、NPFFニューロンの活動が十二指腸の充満イベントの約22秒後に一貫してピークに達することが確認された。これらのニューロンは、栄養素および伸展（マンニトール）の十二指腸内（ID）注入には反応するが、生理食塩水には反応せず、その活性化レイテンシはIG注入よりもID注入の方が速かった。これは、これらのニューロンが口腔感覚的な手がかりではなく、摂食後の腸管信号を追跡していることを裏付けている。
3. 運動の相反的制御： NPFFニューロンのオプトジェネティック刺激は、協調的な運動プログラムを誘発する：
   • 胃の抑制： 幽門部の収縮率を変えることなく胃の排出を有意に抑制した。これは、胃の制御が幽門括約筋に対して行われていることを示唆している。
   • 腸の加速： 近位十二指腸からの内容物の通過を加速させ、小腸全体の運動性を高めた。EMG記録によれば、刺激は近位十二指腸における収縮を引き起こし、それが遠位へと伝播した。
4. 摂食の双方向的制御： NPFFニューロンの活性化は、食物摂取を双方向に制御する。刺激は、固形物（飼料、高脂肪食）および液体（グルコース、イントリリピッド）の両方の摂取量を減少させたが、これは主に一回あたりの摂食量（bout size）を減少させることによるものであった。逆に、NPFFニューロンのケモジェネティックな抑制は、食物摂取を増加させた。
5. コリン作動性のメカニズム： Fosマッピングにより、NPFFニューロンの主要な出力標的が迷走神経背側運動核（DMV）であり、末梢へ投射する運動ニューロンを著しく活性化させることが特定された。NPFF刺激による食欲抑制効果は、末梢のM3ムスカリン受容体拮抗薬であるダリフェナシンによって消失したが、広域スペクトラム拮抗薬であるアトロピンでは消失しなかった（アトロピンは混乱を招く効果を持つ可能性がある）。これは、NPFFニューロンが中枢的な嫌悪経路を介してではなく、腸に対して作用するコリン作動性メカニズムを介して摂食を抑制していることを示している。

意義と主張
本論文は、胃腸の通過の中心的ペースメーカーとして機能する細胞型――subpostremaに位置するNPFF発現ニューロン――を特定したと主張している。著者らは、これらのニューロンが十二指腸における栄養素の感覚検出を「プッシュ・プル」メカニズムへと変換していると提案している。すなわち、彼らは胃の排出を抑制すると同時に、腸の通過を加速させるのである。この相反的な制御により、次のボラスのために近位腸管が空の状態に保たれ、効果的に食物のフローを制御し、消化のペースを整えている。

さらに、本研究は、これらのニューロンが中枢的な嫌悪経路を介するのではなく、腸へのコリン作動性シグナルを介した運動への影響を通じて、食物摂取を双方向に制御することを立証した。本研究は、行動中の動物における腸―脳シグナリングを解剖するための新しい実験的枠組みを確立した。著者らは、「腸のブレーキ」という古典的な概念は、特定の脳幹細胞型によって駆動される能動的なペースメーカーとして理解されるべきであり、これはcNTSがいかにして胃腸の運動を制御しているかという現在のモデルを修正するものであると示唆している。