DNA replication stress redistributes the histone methyltransferase G9a and activates lineage-specific gene expression

技術要約：DNA複製ストレスによるG9aの再分配と系統特異的な遺伝子発現の活性化

問題提起
DNA複製ストレス（RS）は、エピジェネティックにサイレンシングされているものの「プライミング（準備状態）」にある遺伝子座の再活性化を含む、系統特異的な遺伝子発現の変化を誘導することが知られている。臨床的に重要な例として、鎌状赤血球症（SCD）の標準治療であるヒドロキシウレア（HU）処理に伴う、赤血球前駆細胞における胎児ヘモグロビン（HbF）の再活性化が挙げられる。HUはジデオキシヌクレオチド（dNTP）合成を阻害することでRSを誘導するが、停止した複製フォークがいかにして遠位の系統特異的遺伝子（HBG1およびHBG2など）の脱抑制を引き起こすのか、その分子メカニズムは未解明であった。特に、アクセス可能でありながらコアリプレッサーによって転写的にサイレンシングされている遺伝子が、どのようにしてRSによって脱抑制されるのかは不明であった。

手法
著者らは、赤血球細胞モデル（HUDEP-2不死化前駆細胞および初代CD34+ HSPC）、薬理学的摂動、および高度なゲノミクス技術を組み合わせた多角的なアプローチを用いた：

• 薬理学的誘導： RSによる効果を一般的なDNA損傷や分化から区別するため、様々な直交的なメカニズムでRSを誘導する薬剤（HU、アフィディコリン、デシタビンなど）を使用した。
• レポーターシステム： 内因性のHBG2プロモーターによって駆動されるライブセルmCherryレポーターを作成し、単一細胞およびソートされた集団（A細胞：低HbF、F細胞：高HbF）におけるHBG活性化のダイナミクスを追跡した。
• エピジェネティック・プロファイリング： CUT&RUNを用いて、ゲノムワイドおよびグロビン遺伝子座におけるヒストン修飾（H3K9me2、H3K9me3、H3K27me3、H3K9ac、H3K27ac）および転写因子/コアリプレッサーの結合（G9a、WIZ、BCL11A）をマッピングした。ATAC-seqによりクロマチンアクセシビリティを評価した。
• トランスクリプトミクス： 核RNA-seqおよび単一細胞RNA-seqデータの再解析を用い、転写プログラムと分化状態を定義した。
• メカニズムの検証：
  • 分画法： タンパク質の局在を追跡するために、細胞内分画（可溶性 vs クロマチン結合型）を行った。
  • 過剰発現： G9aのレベルが制限要因であるかをテストするために、FLAGタグ付きG9aの過剰発現を行った。
  • 近接結紮アッセイ（PLA）： 停止したフォークにおけるG9a/WIZおよび抑制マークと新生DNA（EdUラベル）の共局在を可視化するために使用した。
  • Click-CUT&RUNおよびiPOND： EdUクリック化学を組み合わせた修飾CUT&RUN、および新生DNA上のタンパク質単離（iPOND）を用いて、停止した複製フォークにおけるG9aおよびH3K9me2の濃縮を生化学的に確認した。
  • 化学的摂動： G9a/GLP複合体の依存性を解明するために、dWIZ-2（WIZ分解用）およびUNC-0646（G9a阻害剤）を使用した。

主な結果

1. RSは分化とは独立してプライミングされた遺伝子座を活性化する： 様々なRS誘導剤は、不死化赤血球細胞および初代赤血球細胞の両方において、HBGの発現とHbFレベルを上昇させた。この活性化は、全般的なクロマチンアクセシビリティの変化や分化状態の変化を伴わずに起こったことから、RSがプライミングされた遺伝子座のエピジェネティックなサイレンシングを直接標的にしていることが示唆された。
2. G9aの再分配とH3K9me2の消失： RS処理は、ゲノムワイドに抑制マークであるH3K9me2の減少、およびG9a/GLP複合体（特にG9aおよびWIZ）のシス制御領域（HBG遺伝子座を含む）への結合低下をもたらした。この消失は、総細胞タンパク質量やG9aの可溶性プールにおける減少を伴わずに起こったため、分解ではなく再分配であることを示唆している。
3. G9aは制限的であり、フォークに隔離される： 可溶性G9aのプールは自然に低い。G9aの過剰発現は、RS誘発性のHBG活性化を部分的に抑制したことから、G9aは抑制のための制限要因であることが示唆された。決定的なことに、PLA、Click-CUT&RUN、およびiPOND実験により、RS中にG9aが停止した複製フォークに蓄積することが示された。この蓄積はDNA結合タンパク質WIZに依存していた。
4. 活性化のメカニズム： 著者らは、停止した複製フォークが「シンク（吸収源）」として機能し、制限的なG9a/WIZ複合体を本来の標的サイト（プライミングされた遺伝子）から引き離して隔離すると提案している。このコアリプレッサーのHBGや他のGATA1/2駆動型遺伝子からの枯渇が、H3K9me2の消失とそれに続く転写活性化を引き起こす。
5. 系統特異性： RSによって脱抑制される遺伝子は、GATA1/2モチーフおよび赤血球系プログラムに富んでいた。H3K27me3（PRC2媒介）も一部の消失を示したが、赤血球特異的な応答の主要な駆動因子はG9a/GLP複合体の再分配であった。
6. ATR/HRIからの独立性： HBGのRSによる活性化はATRシグナルおよびHRIキナーゼに依存しておらず、これら標準的なDNA損傷応答経路とは異なるメカニズムであることを示した。

意義および主張
本論文は、DNA複製ストレスがいかにして系統特異的な遺伝子発現変化を誘導するかについてのメカニズム的説明を提供すると主張している。中心的な知見は、停止した複製フォークがコアリプレッサー（具体的にはG9a/WIZ複合体）を物理的にそのゲノム標的から引き離すということである。これらのコアリプレッサーは制限的な量しか存在しないため、フォークへの隔離が、HBGのようなプライミングされた遺伝子座における全般的な枯渇をもたらし、結果として系統特異的な遺伝子の脱抑制を引き起こす。

このモデルは以下を説明する：

• SCDにおけるヒドロキシウレアの有効性： なぜ複製ストレス因子であるHUがHBGを再活性化し、HbFを増加させるのかという点について、臨床的な使用に対するメカニズム的根拠を明確にした。
• エピジェネティックな可塑性： 複製ダイナミクスが、エピジェネティック制御因子の可用性を変化させることで、細胞状態の遷移を決定するという、より広範なメカニズムを示唆している。
• プライミング状態の再活性化： 「プライミングされた」遺伝子座を、ユークロマチン型のリプレッサー（G9a）によってサイレンシングされているが、これらのリプレッサーがフォークへと転用される際に特異的に脱抑制を受けやすい領域として定義した。

著者らは、G9aの再分配が赤血球系の応答を説明する一方で、非赤血球系の文脈では他の因子が関与している可能性があること、また、G9aのフォークへの動員メカニズム（能動的か受動的か）にはさらなる調査が必要であることを控えめに述べている。彼らは、これがすべてのRS誘発性変化の唯一のメカニズムであると主張しているのではなく、系統特異的な可塑性の主要な駆動因子としてこれを強調している。