Synergistic Microbiologically Influenced Corrosion of SLM TC4 by Co-culture of Streptococcus mutans and Veillonella dispar via Riboflavin-Mediated Extracellular Electron Transfer

*技術要約：Streptococcus mutansとVeillonella disparの共培養による、リボフラビンを介した細胞外電子伝達を伴うSLM製TC4の相乗的な微生物腐食影響*

問題提起
歯科インプラント、特に選択的レーザー溶融（SLM）法を用いて製造されたTi-6Al-4V（TC4）合金は、インプラント周囲炎および微生物腐食（MIC）による故障の可能性がある。これまでの研究は、主に単一種のバイオフィルムや代謝物駆動型の腐食（M-MIC）に焦点を当ててきたが、口腔環境は通常、より複雑で相乗的な多種共生コミュニティを形成している。酸生成菌であるStreptococcus mutansと硝酸塩還元菌であるVeillonella disparの共培養が、付加製造されたTC4インプラントの腐食を加速させる具体的なメカニズムについては、未だ十分に解明されていない。さらに、口腔内のMICにおける細胞外電子伝達（EET）の潜在的な役割も、これまで見過ごされてきた。

方法論
本研究では、SLM加工されたTC4試験片を用い、嫌気条件下、37℃において14日間にわたり、その腐食挙動を調査するためのin vitroモデルを採用した。実験デザインでは、無菌コントロール、単一種バイオフィルム（S. mutansまたはV. dispar）、および二種共培養の3つの条件を比較した。

• バイオフィルムの特性評価： 共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、バイオフィルムの厚さ、生存率、および細胞、タンパク質、多糖類（EPS）の分布を評価した。電界放出形走査電子顕微鏡（FESEM）により、表面形態およびピッティング（孔食）を観察した。
• 電気化学分析： 開回路電位（OCP）、線形分極抵抗（LPR）、電気化学インピーダンス分光法（EIS）、および定電位分極試験を実施し、腐食速度、電荷移動抵抗（$R_{ct}$）、および腐食電流密度（$i_{corr}$）を決定した。
• メカニズムの探究： EETを介した腐食という仮説を検証するため、V. disparの培養系にリボフラビン（電子シャトル）を添加した。また、酸誘導型の腐食と他のメカニズムを区別するためにpHレベルをモニタリングした。
• 表面およびイオン分析： X線光電子分光法（XPS）を用いて、受動態膜（Ti、Al、V酸化物）の組成および深さ方向のプロファイルを分析した。フレーム原子吸光分光法（FAAS）により、Ti、Al、Vイオンの放出量を定量化した。
• 生物学的安全性評価： L-929線維芽細胞を用い、CCK-8アッセイおよび細胞骨格染色による細胞接着・増殖能の観察を通じて、細胞毒性を評価した。

主な結果

1. バイオフィルムの相乗効果： 二種共培養バイオフィルムは、単一種のバイオフィルムと比較して有意に厚く、密度が高く、より多くのEPSを含んでいた。S. mutansは付着部位と栄養素を提供し、一方でV. disparは代謝酸を消費することで微小環境の酸性化を緩和し、S. mutansによるさらなるEPS合成を促進した。
2. 加速された腐食： 共培養群において最も深刻な腐食が誘発された。二種共培養群の腐食電流密度（$i_{corr}$）は40.7 nA·cm⁻²であり、これは無菌コントロールの約4倍であり、単一種のグループよりも有意に高かった。電荷移動抵抗（$R_{ct}$）は二種共培養群で最も低く、腐食耐性が最も低いことを示した。
3. ピッティングと受動態膜の劣化： CLSMにより、二種共培養バイオフィルムが最も深いピッティング（最大深さ9.4 µm）を引き起こすことが明らかになった。XPS分析では、二種共培養条件下において、保護的なTiO₂の相対含有量が大幅に減少し、より低い酸化状態（Ti₂O₃、TiO）および金属Ti、Al、Vの検出が増加していることが示された。
4. EETメカニズム： 予想に反して、二種共培養系の全体的なpHは上昇しており、酸性化が主要な要因ではないことが示された。しかし、V. disparの培養にリボフラビンを添加すると、$R_{ct}$が著しく低下し、腐食速度が増加したことから、V. disparがリボフラビンを電子シャトルとして利用し、細胞外電子伝達（EET-MIC）を促進していることが確認された。
5. イオン放出と細胞毒性： 二種共培養による腐食溶液は、Ti、Al、Vの最も高いイオン放出をもたらした。イオン放出の増加にもかかわらず、細胞毒性アッセイ（RGR > 75%）は、これらの腐食抽出物がL-929細胞に対して非毒性であることを示した。ただし、これらの抽出物は無菌コントロールよりも細胞の成長と増殖を強く刺激した。

意義と主張
著者らは、本研究が口腔内MICのメカニズムに関する新たな知見を提供し、特にS. mutansとV. disparの相乗効果がSLM製TC4インプラントに与える影響を強調していると主張している。本論文は以下の事項を確立している：

• 多種バイオフィルムは、構造的な複雑性と代謝的な相互依存性により、単一種の菌株よりも攻撃的な腐食環境を作り出す。
• リボフラビンと電気活性なVeillonellaによって媒介されるEET-MICは、従来の酸誘導型腐食とは異なる、口腔内腐食における重要なメカニズムである。
• 受動態膜の劣化（TiO₂の減少）およびそれに続く金属イオンの放出は、これらの相乗的な相互作用によって加速される。
• 開発されたin vitro腐食・細胞毒性モデルは、複雑な微生物環境における医療用金属の長期的な臨床性能および生物学的安全性を評価するための枠組みを提供する。

本研究は、このような相乗的かつ電気的なメカニズムを理解することが、腐食耐性のある口腔材料や高リスク患者向けの戦略を開発するために不可った、と結論付けており、微生物活動による加速された金属イオン放出に伴う潜在的な発がんリスクについては、さらなる調査が必要であると述べている。