H2O2- and Light-Triggered MnO2-Based Nanoswitches for Microenvironment Reprogramming and Photodynamic Therapy of Hypoxic Atherosclerotic Plaques

技術要約：低酸素状態の動脈硬化プラークの微小環境再プログラミングおよび光力学療法のための、H2O2および光によってトリガーされるMnO2ベースのナノスイッチ

問題提起
動脈硬化の進行は、高リスクプラーク内における、M1マクロファージの浸潤、活性酸素種（ROS）の上昇、および深刻なプラーク内低酸素状態（<1% O2）を特徴とする前炎症性微小環境によって引き起こされる。この低酸素状態は、治療介入において二重の課題を提示している：

1. 光力学療法（PDT）の限界： 従来のPDTは、細胞毒性を持つ一重項酸素（$^1O_2$）を生成するために分子状酸素に依存している。低酸素のプラーク微小環境は、酸素依存的なPDTの有効性を著しく制限する。
2. オフターゲット毒性： クロリンe6（Ce6）のような光増感剤は、全身循環中の不完全な消光により、皮膚の光感受性や正常組織への光毒性を引き起こす、構成的な（「常にオン」の）光活性を示すことが多い。

現在の戦略は、低酸素状態を緩和し、炎症微小環境を再プログラミングすると同時に、全身的な副作用なしに疾患部位でのみ治療を活性化することに苦慮している。

方法論
著者らは、特定の病理学的条件によってトリガーされるまで「光力学的にオフ」の状態を維持するように設計された、デュアル刺激応答性ナノスイッチシステム、HA-TEPA/MnO2/Ce6を開発した。

• 合成： ナノスイッチは、以下の逐次反応を介して合成された：
  1. HA-TEPAの形成： 金属キレート剤であるテトラエチレンペンタミン（TEPA）を、M1マクロファージ上に過剰発現しているCD44受容体を標的とするリガンドであるヒアルロン酸（HA）に結合させた。
  2. MnO2の生成： TEPAの強力な還元力を利用して、過マンガン酸カリウム（$K_1MnO_4$）をin situで還元し、二酸化マンガン（$MnO_2$）ナノ粒子を形成した。
  3. Ce6の結合： フォトセンシタイザーであるCe6-NH2を、EDC/NHS化学を用いてHA-TEPA/MnO2バックボーンに共有結合させた。
• 作用機序：
  • 消光状態： 生理的条件下では、$MnO_2$が効率的なエネルギーアクセプターとして機能し、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を介してCe6の蛍光および一重項酸素の生成を消光させ、システムを「オフ」の状態に保つ。
  • トリガーによる活性化： プラーク内に蓄積し、CD44陽性のM1マクロファージに取り込まれると、内因性の過酸化水素（$H_2O_2$）が$MnO_2$の分解を引き起こす。
  • 機能的遷移：
    1. 酸素生成： $MnO_2$が$H_2O_2$の分解を触媒して分子状酸素（$O_2$）を生成し、局所的な低酸素状態を緩和する。
    2. 微小環境の再プログラミング： 低酸素の緩和およびROSの減少によりHIF-1$\alpha$をダウンレギュレートし、前炎症性のM1マクロファージから抗炎症性・炎症解決促進型のM2マクロファージへの極性化を促進する。
    3. PDTの活性化： $MnO_2$の分解によりCe6が放出され、蛍光および光力学的活性が回復する。その後のレーザー照射（670 nm）は、in situでの酸素供給によって強化された高レベルの一重項酸素を生成する。

主要な結果

• 物理化学的特性評価： ナノスイッチは、コロイド安定性を確保するための流体力学的直径〜144 nmおよびゼータ電位-52.7 mVを示した。高い薬物充填量（12.5% Ce6）と効率的な$MnO_2$形成を示した。
• In Vitroにおけるスイッチングと酸素化：
  • システムは、$H_2O_2$が存在しない条件下では蛍光およびPDTの「オフ」状態を維持した。
  • $H_2O_2$（プラーク環境を模倣）への曝露は、$MnO_2$の分解を引き起こし、蛍光および一重項酸素生成の有意な「オフ・トゥ・オン」のスイッチングをもたらした。
  • 低酸素条件下において、ナノスイッチは一重項酸素の生成を維持するために十分な酸素を生成したが、遊離Ce6は効果的にこれを行うことができなかった。
• マクロファージの再プログラミング： 低酸素状態の活性化マクロファージにおいて、ナノスイッチは細胞内ROSおよびHIF-1$\alpha$レベルを有意に減少させた。これにより、CD86/CD44の発現低下とCD206の増加を伴う、M1（CD86+, CD44+）からM2（CD206+）マクロファージへの表現型シフトが確認された。
• In Vivoにおける生体内分布と安全性：
  • ナノスイッチは、遊離Ce6と比較して迅速な全身クリアランスを示し、肺への蓄積が最小限であったため、オフターゲットへの曝露を低減した。
  • 極めて重要なことに、ナノスイッチはレーザー照射時において皮膚の光毒性をほとんど示さなかったのに対し、遊離Ce6は顕著な紅斑および表皮損傷を引き起こした。これは、消光メカニズムの有効性を裏付けている。
• 低酸素プラークにおける治療効果：
  • 低酸素性動脈硬化プラークモデル（ワルファリン含有飼料を与えたApoE-/-マウス）を用いた実験において、光活性化されたHA-TEPA/MnO2/Ce6ナノスイッチは、プラーク負荷（38.4%減少）、マクロファージ浸潤（56.7%減少）、および脂質コア含有量（46–55%減少）を有意に減少させた。
  • 本治療は、コラーゲン含有量の増加（174%増加）を通じてプラークの安定化を促進した。
  • 治療効果は、ナノスイッチの蓄積とレーザー活性化の両方に依存していた。遊離Ce6または非照射のナノスイッチでは、同等の結果は得られなかった。

意義および主張
著者らは、本研究が、微小環境の再プログラミングと強化された活性化光力学療法を統合した状態切替可能な治療プラットフォームを確立したと主張している。本研究の意義は、以下の点にある：

1. 低酸素の克服： 内因性の$H_2O_2$を利用してin situで酸素を生成することにより、低酸素状態の動脈硬化プラークにおけるPDTの主要な制限事項を回避している。
2. バイオセーフティの確保： 正常組織における「オフ」状態は、Ce6ベースの治療における大きな臨床的障壁である皮膚の光感受性を効果的に排除する。
3. デュアルメカニズム： 本プラットフォームは、光毒性による前炎症性M1マクロファージの除去と、低酸素緩和による残存マクロファージの炎症解決促進型M2表現型への再プログラミングを同時に達成し、相乗的な成果を実現する。

本論文は、MnO2ベースのナノスイッチ戦略が、低酸素の動脈硬化プラークのような複雑な微小環境を標的とし、全身毒性を誘発することなく、環境応答的に活性化される炎症性疾患の治療に対する有望なアプローチを提供すると結論付けている。