A Novel Homozygous Canonical Splice-Donor VWF Variant Causing Type 3 von Willebrand Disease in an Iranian Patient: Case Report

技術要約：Type 3 von Willebrand 病を引き起こす、新規のホモ接合型カノニカル・スプライス・ドナー VWF 変異

問題提起
Type 3 von Willebrand 病（VWD）は、VWF（von Willebrand factor）のほぼ完全な欠乏と、それに伴う第VIII因子（FVIII）の二次的な減少を特徴とする、最も重篤な形態の VWD である。これは通常、常染色体劣性遺伝形式で継承され、ナンセンス変異、フレームシフト変異、およびカノニカルなスプライス部位変異を含む、二アレル性の機能喪失変異によって引き起こされる。臨床診断は止血学的検査に依存するが、診断の確定、遺伝形式の明確化、および遺伝カウンセリングを容易にするためには、分子標的による特性解析が不可欠である。イランのような同族婚の割合が高い集団では、重篤な常染色体劣性疾患の負担が高まっている。しかし、イラン人の患者における VWF 遺伝子の変異スペクトルはまだ完全には定義されておらず、疾患の原因となる変異のデータベースを拡大するためには、新規の病原性変異を特定する必要がある。

方法論
本研究は、重度の出血表現型を示すイラン人女性（16歳）の症例報告を提示している。調査は以下の多段階の診断ワークフローに従って行われた：

1. 臨床および検査評価： 患者に対し、VWF 抗原（VWF:Ag）、VWF リストセチンコファクター活性（VWF:RCo）、第VIII 因子活性、凝固スクリーニング（PT、aPTT）、および血小板機能検査（リストセチン誘発血小板凝集）を含む包括的な止血検査を実施した。
2. ゲノム解析： Twist Comprehensive Exome Panel および Illumina NovaSeq 6000 プラットフォームを用い、プロバンド（発端者）に対して全エクソーム解析（WES）を実施した。データは GRCh38/hg38 にアライメントされ、GATK Best Practices を用いて変異の呼び出しを行った。
3. 変異の優先順位付けおよびアノテーション： 候補変異は、アレル頻度、接合性、および予測される分子学的帰結に基づいてフィルタリングされた。アノテーションには Ensembl VEP、gnomAD、ClinVar、HGMD、およびその他のデータベースを使用した。in silico ツール（CADD、MutationTaster、GERP++、MaxEntScan、SpliceAI）を用いて、機能的影響およびスプライシング破壊の予測を行った。
4. 検証および分離解析： 特定された変異は、双方向サンガーシーケンシングによって確認された。両親に対して分離解析を行い、遺伝形式を決定した。
5. 分類： 変異は、PVS1 基準に関する ClinGen の推奨事項を取り入れ、米国医学遺伝学会（ACMG）および分子病理学会（AMP）のガイドラインに従って分類された。

主な結果

• 臨床表現型： 患者は乳児期から繰り返される粘膜皮膚出血（鼻出血、歯肉出血、軟部組織の血腫）を呈していた。検査結果は、著明に減少した VWF:Ag（4%）、VWF:RCo（3%）、および FVIII 活性（4%）を示し、混合試験で補正されるものの延長した aPTT（75 秒）が認められた。リストセチン誘発血小板凝集は消失していた。これらの所見は Type 3 VWD と一致していた。
• 遺伝学的知見： WES により、VWF 遺伝子のホモ接合型カノニカル・スプライス・ドナー変異 NM_000552.5:c.2186+1G>A が特定された。この変異は、イントロン 16 のドナースプライス部位における不変のグアニン（+1 位）に影響を与える。
• 変異の特性：
  • 新規性： この変異は、解析時点において gnomAD v4.1、ClinVar、HGMD、および既報の文献には存在しなかった。
  • In Silico 予測： ツールは、疾患を引き起こす効果（MutationTaster 確率 1.0）、強い進化的な制約（GERP++ スコア 4.77）、およびネイティブなドナースプライス部位の著しい破壊（SpliceAI delta-score ≥0.5）を予測した。
  • 分離： サンガーシーケンシングにより、プロバンドは当該変異に対してホモ接合体であることが確認され、両親はヘテロ接合体のキャリアであり、これは同族婚（従兄妹の再従兄弟関係）の家系における常染色体劣性遺伝と一致した。
• 分類： 変異は、ACMG/AMP フレームワークに基づき Pathogenic（病原性） と分類された：
  • PVS1 (Very Strong): Type 3 VWD の既知のメカニズムである遺伝子における機能喪失に関わる、カノニカルなドナースプライス部位の不変の +1 ヌクレオチドに影響を与えている。
  • PM2_Supporting: 集団データベースに存在しない。
  • PP4: 患者の表現型（重度の出血、著明に低い VWF/FVIII）は、Type 3 VWD に対して非常に特異的である。

意義および主張
本論文は、この報告が VWF 遺伝子の未報告の病原性変異を特定し、特にイラン集団における Type 3 VWD の変異スペクトルを拡大することを主張している。著者らは以下の点を強調している：

• 診断的価値： 本症例は、臨床的および検査学的所見が重度であるものの、特定の遺伝的原因が不明な場合に、Type 3 VWD を確定するための分子診断の有用性を示している。
• 遺伝カウンセリング： 特定の変異を特定し、常染色体劣性の遺伝形式を確認することは、キャリア検出、リスクのある親族へのカスケード検査、および生殖に関する選択肢に関する情報に基づいた遺伝カウンセリングを容易にする。
• 集団遺伝学： この知見は、近東地域における同族婚が、重篤な劣性疾患におけるホモ接合型の機能喪失変異の高頻度な寄与に寄与しているという観察と一致している。
• 限界： 著者らは、具体的なスプライシングの結果（例：エキソンスキッピングかイントロン保持か）を決定的に確認するための RNA ベースの機能解析が欠けていること、および VWF マルチマー解析が極めて低い抗原レベルのために実施されなかったことを控えめに述べている。

結論として、本研究は、新規のホモ接合型スプライス部位変異によって分子学的に確認された Type 3 VWD の症例を提供しており、重篤な遺伝性出血性疾患の管理における遺伝子検査の重要性を再確認するものである。