A Novel Benzimidazole-π-Bridge-Dicyanoisophorone-Type Near-Infrared Fluorescent Probe for Rapid Monitoring of Hydrogen Sulfide Based on a Cascade Thiolysis Strategy

技術要約：硫化水素の迅速モニタリングのための、新規ベンズイミダゾール-π-ブリッジ-ジシアノイソフォロン型近赤外蛍光プローブ

問題提起
硫化水素（H₂S）は、神経調節、酸化還元恒常性、および代謝調節に関与する重要な生理学的調節因子であるが、その異常な変動は高血圧、糖尿病、肝硬変などの病理と関連している。さらに、H₂Sはタンパク質を豊富に含む食品の腐敗を示す主要な指標でもあり、健康リスクをもたらす。既存の検出法（滴定法、電気化学法）は存在するものの、リアルタイムモニタリングに必要な操作の簡便性、感度、およびin situ（現場）可視化能力に欠けることが多い。従来の2,4-ジニトロフェニル（DNP）エーテルチオリシスに基づく蛍光プローブは、通常、ドナー部位に単一のDNPケーシング基を採用している。著者らは、このモノDNP戦略はチオリシス効率が不十分になりやすく、結果として感度の制限、応答速度の遅延、および弱い光学信号をもたらすことが多いと指摘している。

手法
これらの限界を克服するために、著者らはN-Bu-DCIB-2DNPと命名された、新規なデュアルDNPケーシング近赤外（NIR）蛍光プローブを設計・合成した。

• 分子設計： このプローブは、D-π-A（ドナー-π-アクセプター）構造を利用しており、N-アルキル化ベンズイミダゾール（ドナー）を二重ビニレンリンカーを介してジシアノイソフォロン（DCI、アクセプター）と結合させている。
• デュアル応答戦略： 従来のプローブとは異なり、N-Bu-DCIB-2DNPは2つの異なる応答部位を備えている。すなわち、ドナー上のDNPエーテルと、DCIアクセプター上のDNP修飾された電子欠乏性四級炭素である。この設計は、分子内電荷移動（ICT）プロセスを完全に阻害し、プローブを非蛍光状態にロックすることを目的としている。
• 合成： 合成は3段階のプロセスで行われた。(1) N-Bu-B中間体を形成するための縮合、(2) DCIユニットを付加するためのクネーフェナーゲル縮合によるN-Bu-DCIBの生成、そして(3) 2,4-ジニトロフルオロベンゼンを用いたエーテル化による2つのDNP基の導入であり、これが最終的なプローブとなる。
• 特性評価： プローブの特性評価には、NMR、HRMS、UV-vis吸収、および蛍光分光法を用いた。そのメカニズムは、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）および密度汎関数理論（DFT）計算を用いて解明された。
• 応用： プローブは、溶液中での感度と選択性の検証、食品の腐敗検知のためのろ紙への固定、および複雑なマトリックス中のスパイクされた茶抽出液サンプルへの適用においてテストされた。

主な貢献

1. カスケードチオリシス・メカニズム： 本論文は、H₂Sが2つのDNP基を連続的に切断する「カスケードチオリシス」戦略を紹介している。最初の切断はDCIユニットの電子欠乏性四級炭素で起こり、続いてドナー上のDNPエーテルの切断が起こる。この二段階の切断プロセスにより、ICT経路が完全に回復する。
2. デュアル発光NIRプローブ： このプローブは、610 nmおよび745 nmで明確なデュアル発光を示し、大きなストークスシフトを持ち、生物学的および環境的応用において有利な近赤外（NIR）領域で作動する。
3. 高い性能指標： プローブは迅速な応答時間（6分以内に安定したプラトーに到達）と、極めて低い検出限界である51.48 nM（蛍光ベース）を示す。
4. 実用的な有用性： 本研究は、携帯用テストストリップを用いた腐敗した鶏肉および豚肉から放出されるH₂Sの可視的検出、および茶の浸出液サンプルにおける正確な定量を通じて、プローブの有用性を検証している。

結果

• 光学応答： H₂S（NaHSとして）の添加に伴い、プローブの吸収ピークは340 nmから690 nmへとレッドシフトし、無色から黄緑色への目に見える色の変化を伴った。蛍光は「オン」となり、610 nmと745 nmに発光ピークを示した。
• 選択性： プローブは、広範な干渉イオン（例：F⁻、Cl⁻、CN⁻）および生物学的チオール（例：GSH、Cys）に対して優れた選択性を示し、無視できる程度の干渉しか観察されなかった。
• 動力学および安定性： 蛍光強度は6分以内に安定した。プローブは広いpH範囲（3–11）において安定かつ効果的であった。
• メカニズムの確認： DFT解析により、初期状態ではHOMOがベンズイミダゾールに局在し、LUMOがDNP修飾された四級炭素にあることが確認され、これが光誘起電子移動（PET）と消光を促進していることが示された。LC-MSは、中間体（m/z 655.2）および最終生成物（m/z 489.2）の種を特定し、二段階の切断経路を裏付けた。
• 実世界でのテスト：
  • 食品の腐敗： プローブをロードしたテストストリップは、腐敗した肉から発生するH₂Sガスを正常に検出し、UVライト下で無蛍光から明るいオレンジイエローへと変化した。
  • 水サンプル： 茶の浸出液サンプルにおいて、プローブは**85.8%から117.3%**の範囲のスパイク回収率を達成し、相対標準偏差（RSD）は7.0%から10.3%の間であり、複雑な水環境における堅牢な性能を示した。

意義および主張
著者らは、N-Bu-DCIB-2DNPが、カスケードチオリシス・メカニズムを通じて従来のモノDNPプローブの効率の限界に対処することにより、H₂Sセンシングにおける重要な進歩を遂げたと主張している。デュアル発光信号を備えた、迅速、高感度、かつ選択的な検出を提供するこのプローブは、食品の鮮度のリアルタイムモニタリングおよびH₂S関連の生理学的疾患の早期診断の両方にとって有望なツールである。テストストリップやスパイクされた水サンプルへの適用成功は、実用的、オンサイト、およびポイント・オブ・ケア分析への潜在能力を強調している。著者らは、現在のプローブはかなりの実用的可能性を示しているものの、今後の課題は、生物学的環境におけるより効率的な検出のために、生物学的適合性と光学特性を改善するための構造の最適化に焦点を当てることで、より高度なものになると結論付けている。