PINK1-dependent Mitophagy Mediates CD8+ T Cell Residency and Drives Psoriatic Relapse via CCR4-CCL17/22 Recruitment

技術要約：PINK1依存的なミトファジーがCD8+ T細胞の組織常在性を媒介し、CCR4-CCL17/22によるリクルートメントを介して乾癬の再発を駆動する

問題提起
乾癬は慢性炎症性皮膚疾患であり、治療の中止後に以前罹患した部位に病変が再発するという、in situ（局所）での再発傾向が高いことが特徴である。この再発は主に、皮膚微小環境内に持続するCD8+ 組織常在型メモリーT細胞（TRM）によって駆動されている。CD8+ TRM細胞が再発に関与していることは確立されているが、過酷な乾癬微小環境において、それらの長期的な持続と代謝適応を維持する具体的なメカニズムは依然として不明である。特に、ケモカインシグナル伝達、ミトコンドリア品質管理（ミトファジー）、および常在表現型の維持との関連性は、十分に解明されていない。

手法
本研究では、ヒト臨床検体とマウスモデルを組み合わせたマルチモーダルなアプローチを採用した：

• ヒト検体： 乾癬患者（病変部および非病変部）および健康対照者の皮膚生検を用い、シングルセル・トランスクリプトミクス、空間的トランスクリプトミクス、およびマルチプレックス免疫蛍光染色を実施した。
• マウスモデル： 野生型C57BL/6マウスおよびPink1ヘテロ接合体ノックアウト（Pink1+/-）マウスを用いて、イミキモド（IMQ）誘発乾癬再発モデルを確立した。
• 薬理学的介入：
  • ミトファジー活性化： PINK1-Parkin経路を活性化するため、CD8+ T細胞をT0467およびABT737で処理した。
  • CCR4遮断： CCR4シグナル伝達を阻害するため、in vitro（ヒトCD8+ T細胞）およびin vivo（マウスモデル）においてCCR4阻害剤AZD2098を使用した。
• 解析手法：
  • オミクス： 非教師ありクラスタリング（UMAP）、差分的発現解析、およびミトファジー遺伝子モジュール・スコアリング（AUCellを使用）。
  • イメージング： ミトコンドリア超微構造の透過型電子顕微鏡（TEM）、およびタンパク質共局在（PINK1、CD69、CD103、CCR4、LC2マーカー）のためのマルチプレックス免疫蛍光染色。
  • 機能アッセイ： 表面マーカー（CD69、CD103、CCR4）およびサイトカイン産生（IL-17、IFN-γ）のフローサイトメトリー、JC-1染色によるミトコンドリア膜電位、ATPアッセイ、ならびに経路分子（PINK1、Parkin、BNIP3）のウェスタンブロッティングおよびRT-qPCR。

主要な貢献と知見

1. PINK1依存的なミトファジーが常在性と再発を促進する：

   • シングルセル解析により、ミトファジーシグネチャーは非病変部と比較して乾癬病変部で有意に濃縮されていることが明らかになった。
   • 高いミトファジーシグネチャーを持つCD8+ T細胞は、常在マーカーであるCD69およびITGAE（CD103）を高発現していた。
   • In vivoにおいて、Pink1+/-マウスは、発症期および再発期の両方において、乾癬病変の重症度（紅斑、鱗屑、およびPASIスコアの低下）およびCD69/CD103の発現低下を示した。逆に、薬理学的にPINK1介在性ミトファジーを活性化（ABT737を介して）すると、病変の重症度が増悪し、常在マーカーの発現が増加した。
   • TEMにより、Pink1欠損がミトコンドリアの損傷（膨潤、クリステの無秩序化）を引き起こす一方で、ミトファジーの活性化がミトファゴソームの集簇をもたらすことが確認された。

2. CCR4が過剰活性化ミトファジーを有する病原性サブタイプを特定する：

   • 乾癬病変内において、T細胞は高ミトファジー群と低ミトファジー群に層別化された。高ミトファジー群はCCR4の発現上昇を示した。
   • CCR4高発現（CCR4hi）T細胞は、ミトファジー、メモリー分化、およびTh17/IL-17シグナルに関連する遺伝子が濃縮されていた。
   • 空間的トランスクリプトミクスおよびマルチプレックス免疫蛍光染色により、病変内の構造内でCCR4、CD8、およびPINK1が共局在していることが確認された。

3. CCR4シグナルがPINK1の発現とミトコンドリア恒常性を調節する：

   • ヒトCD8+ T細胞においてCCR4をAZD2098でブロックすると、損傷したミトコンドリアの蓄積（膨潤、クリステの消失）、ミトコンドリア膜電位の低下、およびATPレベルの減少が認められた。
   • メカニズムとして、CCR4遮断はPINK1のmRNAおよびタンパク質レベルを低下させたが、ParkinやBNIP3/BNIP3Lの発現には有意な影響を与えなかった。これは、CCR4シグナルがミトファジーを開始するためにPINK1の発現を特異的に駆動することを示唆している。
   • CCR4阻害は、ミトコンドリアマーカーであるTOMM20とオートファジーマーカーであるLC3の共局在を減少させ、ミトファジーの抑制を裏付けた。

4. 可逆性と治療的可能性：

   • CCR4遮断（AZD2098）によって引き起こされるCD69およびCD103の発現減少は、PINK1-Parkin経路を同時に活性化（T0467またはABT737を使用）することで回復可能であった。これは、CCR4依存的な常在性がPINK1依存的なミトファジーを介して行われていることを実証している。
   • マウスモデルにおいて、AZD2098処理は臨床症状を緩和し、CD69/CD103の発現を減少させた。TEMおよび免疫蛍光染色は、CCR4阻害がin vivoにおけるPINK1依存的なミトファジー経路を阻止し、ミトコンドリア機能不全とT細胞の持続性低下をもたらすことを確認した。

5. LC2-CCR4 空間的ニッチ：

   • 解析の結果、循環CCR4+ T細胞は乾癬患者において減少しており、これは疾患の重症度と相関していることから、皮膚内へのリクルートメントを示唆している。
   • CCR4のリガンドであるCCL17およびCCL22は、主にLangerhans細胞タイプ2（LC2）集団（CD63およびCLEC10Aによって同定）によって産生されていることが判明した。
   • 空間的トランスクリプトミクスは、LC2細胞とCCR4+ T細胞が、TRM細胞（CD3+CD69+ITGAE+）と大きく重複する、極めて選択的な高密度な空間クラスターを形成していることを示した。これは、LC2が化学走性ニッチをオーケストレートし、CCR4+ T細胞のリクルートメントと常在状態への移行を促進していることを示唆している。

意義および主張
本論文は、これまで認識されていなかった「免疫代謝調節軸」であるLC2-CCL17/22-CCR4-PINK1-ミトファジー・カスケードを記述していると主張している。著者らは以下の通り述べている：

• CCR4は単なる化学走性受容体としてだけでなく、CD8+ T細胞におけるPINK1依存的なミトファジーを維持する不可欠な代謝調節因子として機能する。
• このミトファジーは、炎症ストレス下での代謝恒常性の維持を可能にする病原性のドライバーであり、それによって長期間の常在とin situでの再発を加速させる。
• LC2由来のケモカインとCCR4+ T細胞の間の空間的相互作用が、常在表現へのフェノタイプ転換をサポートする構造化されたニッチを形成する。
• この軸（CCR4のブロックまたは固有のミトファジーの阻害）を標的とすることは、局所的な免疫記憶の痕跡を根絶することにより、乾癬再発のサイクルを断ち切るためのメカニズム的基盤を提供する。