Plasma-Activated Water and Oregano Essential Oil Nanoliposomes Integrated into a Hydroxyethyl Cellulose Coating for Microbial Control of Seafood

技術要約：水産物の微生物制御のための、プラズマ活性水およびオレガノ精油ナノリポソームを組み込んだヒドロキシエチルセルロースコーティング

問題提起
プラズマ活性水（PAW）は、過酸化水素、亜硝酸塩、硝酸塩などの活性酸素・窒素種（RONS）を含有していることから、有望な非熱的抗菌システムとして認識されている。しかし、液状のPAWを食品表面に直接塗布することは、急速な流出、拡散、および活性種の減衰によって制限されており、貯蔵中の抗菌活性の持続性を妨げている。PAWをハイドロゲルネットワーク内に固定化（プラズマ活性ハイドロゲル、以下PAH）することは、RONSの供給を維持する戦略となるが、ポリマーマトリックス濃度が食品システムにおける保水性とRONS放出に与える具体的な影響については、依然として十分に解明されていない。さらに、酸化的なRONSのみに依存することは、抗酸化機能の面で限定的である。そのため、強力な抗菌・抗酸化特性を持つオレガノ精油（OEO）のような補完的な生理活性剤を統合する必要がある。しかし、OEOの疎水性、揮発性、および水への分散性の低さは、親水性のハイドロゲルマトリックスへの直接的な組み込みを困難にしている。

方法論
本研究では、PAW由来のRONSとオレガノ精油ナノリポソーム（OEONL）を統合した、ヒドロキシエチルセルロース（HEC）ベースの活性コーティングを開発した。研究は以下の段階を経て進行した：

1. PAWおよびハイドロゲルの調製： PAWは、ドライエアを用いた二重放電システムを用いて生成された。HECをこのPAWに溶解し、2%、3%、および4% (w/v) の濃度のHECハイドロゲルを作成した。これらの製剤について、最適なマトリックス濃度を特定するために、水分の吸収、保水能（WHC）、およびRONS放出プロファイル（H₂O₂, NO₂⁻, NO₃⁻）を4°Cおよび25°Cで評価した。
2. ナノリポソームの調製： オレガノ精油ナノリポソーム（OEONL）は、大豆レシチンと超音波処理を用いて調製された。得られた懸濁液は、粒子径、多分散指数（PDI）、ゼータ電位、および封入効率（EE）について特性評価された。
3. 複合コーティングの処方： 最適なHEC/PAWハイドロゲルを、遊離OEOまたはOEONLのいずれかと組み合わせ、PAH-OEOおよびPAH-OEONLコーティングを作成した。対照群には、HEC/脱イオン水およびOEOを含まないHEC/PAWを用いた。
4. 物理化学的特性評価： コーティングの微細構造（SEM）、化学的相互作用（ATR-FTIR）、熱安定性（TGA）、および抗酸化能（DPPHラジカル消去活性）を分析した。
5. 微生物チャレンジテスト： エビ（Litopenaeus vannamei）およびキンメダイのフィレ（Trachinotus ovatus）に、Salmonella ATCC 14028およびVibrio parahaemolyticus ATCC 17802を接種した。試料にコーティングを施し、4°Cおよび25°Cで貯蔵した。全生存菌数（TVC）、V. parahaemolyticus、およびSalmonellaのレベルを一定期間モニタリングした。

主な貢献および結果

• ハイドロゲルマトリックスの最適化： テストされた濃度の中で、3% (w/v) のHECが、水分の吸収、保水、およびRONSの持続性において最も良好なバランスを提供した。ワイブルモデルによる速度論的モデリングにより、この濃度が最適な水和とネットワークの安定性を促進することが確認された。3% HECハイドロゲルは、最高の平衡水分吸収量を示し、4°Cにおいて14日間にわたり初期含水量の55%以上を保持した。
• RONSの持続性： 3% HEC/PAWハイドロゲルは、効果的な貯蔵庫として機能し、H₂O₂, NO₂⁻, およびNO₃⁻の放出を維持した。特筆すべきは、NO₃⁻濃度が漸増的に増加したことであり、これは不安定な窒素種が変換されていることを示しており、3%の製剤が最も高い全体的な蓄積を示した。
• ナノリポソームの特性： OEONLは、平均粒子径102.31 ± 1.46 nm、狭い分布（PDI 0.264）、および高い封入効率（79.31 ± 2.86%）を示した。遊離OEOは、テストされた両方の病原体に対して0.625 μL/mLの最小発育阻止濃度（MIC）を示す抗菌活性を示した。
• 物理化学的統合： 走査型電子顕微鏡（SEM）により、OEONLを組み込むことで、遊離OEOを用いたコーティングの粗く不均一な形態と比較して、より均質で緻密なコーティング微細構造が得られることが明らかになった。ATR-FTIR分析は、HECの主要な化学的特徴が保持されていることを示しており、これはナノリポソームが物理的な結合ではなく物理的な統合（physical integration）であることを示唆している。
• 抗酸化能の向上： OEONLの組み込みにより、コーティングのDPPHラジカル消去活性が著しく向上した（PAH-OEONLでは約47%に達したが、対照群では約2-3%であった）。この活性は、試料の質量および抽出時間に依存していた。
• 微生物制御能：
  • 4°Cにおいて： PAH-OEONLコーティングは、微生物による腐敗を有意に遅延させた。エビ肉においては、TVCが腐敗閾値である7 log CFU/gに達する時間を、無コーティング時の6日目から16日目へと遅らせた。キンメダイのフィレにおいては、この遅延は4日目から14日目へと延び、約10日間の棚持ち期間の延長を意味した。また、このコーティングはV. parahaemolyticusおよびSalmonellaを効果的に抑制し、6日目において無コーティングの対照群と比較して、菌数を約3.5–3.7 log₁₀ CFU/g減少させた。
  • 25°Cにおいて： コーティングは明白な抗菌活性を維持し、室温での24時間の貯蔵後も、TVCおよび病原菌数を無コーティングの対照群よりも有意に低いレベルに保った。

意義および主張
著者らは、PAW由来の反応種の持続的な放出と、ナノリポソームによって届けられるオレガノ精油の相補的な抗菌・抗酸化機能を組み合わせることで、水産物の保存における実行可能な戦略を提示していると主張している。OEONLをHEC/PAWマトリックスに統合することは、OEOの疎水性と揮発性の課題に対処すると同時に、コーティングの物理的な均質性を高めるものである。得られたPAH-OEONLシステムは、冷蔵および常温の両方の条件下で、総微生物数および特定の食中毒病原菌の増殖を遅らせることで、水産物の棚持ち期間を効果的に延長する。本研究は、この活性コーティングのアプローチが微生物制御において有望であることを結論付けているが、著者らは、感覚品質、酸化安定性、および商業的な貯蔵条件下での性能を評価するためには、さらなる研究が必要であると述べている。