Extension of the phenotypic spectrum of BMP1-related disorders through a novel homozygous variant identified in a foetus with intrauterine growth retardation

技術要約：BMP1関連疾患の表現型のスペクトルの拡大

問題提起
骨形成不全症（OI）は、主に骨の脆弱性を特徴とする遺伝性の結合組織疾患の異質的なグループである。常染色体優性形式は通常COL1A1またはCOL1A2の変異によって引き起こされるが、常染色体劣性形式のOIはBMP1遺伝子の欠損に起因する場合がある。BMP1は、I型プロコラーゲンのC末端プロペプチドを切断する責任を負う、BMP1およびその長いアイソフォームであるmTLDという2つの必須メタロプロテアーゼをコードしている。この切断は、コラーゲンフィブリル形成における重要なステップである。さらに、これらの酵素は、細胞外マトリックスの構築およびTGF-β/BMPシグナル経路の活性化に不可欠な、chordinやトロンボスポンジン-1（TSP1）を含む他の基質も処理する。

現在までに報告されているすべてのBMP1関連OIの症例は、出生後に発症しており、その時期は幼児期から青年期まで多岐にわたる。臨床的スペクトルは、反復的な骨折、骨格変形、および成長不全に限定されてきた。胎生期に検出される、子宮内発育遅延（IUGR）や骨の脆弱性を超えた複雑な奇形を伴う重篤な症候群的表現型を引き起こすBMP1変異に関するデータは不足している。

方法論
本研究では、臨床的出生前診断、ゲノムシーケンシング、および機能的生化学アッセイを組み合わせた多角的なアプローチを用いた：

1. 臨床および遺伝学的解析： 妊娠週数（GW）23+2において、重度のIUGR、小頭症、両側底屈足、および頭蓋異常を呈した胎児に対し、羊水細胞および両親の血液を用いてトリオ全エクソームシーケンシング（WES）を実施した。変異は、アレル頻度、分離、およびin silicoの病原性予測（MetaRNN、MISTIC、およびスプライス部位予測ツールを使用）に基づいてフィルタリングされた。
2. スプライシング機能アッセイ： 特定された変異がRNAプロセシングに与える影響を評価するため、野生型および変異型エキソン6/イントロン6領域を含むミニジーン構築物（pSpliceExpress）を作成した。RT-PCRをこれらの構築物および培養された胎児羊水細胞から抽出されたRNAに対して行い、エキソン・スキッピングおよび転写産物アイソフォームを評価した。
3. タンパク質発現および精製： 野生型（WT-FLAG）および変異型（Arg279Gly-FLAG）BMP1タンパク質を293-EBNA細胞で発現させ、アフィニティークロマトグラフィー（Reactive Red 120およびAnti-FLAGカラム）を用いて精製した。
4. 生化学的特性評価：
   • ウェスタンブロッティング： 患者の胎児細胞の細胞上清およびコントロールを分析し、BMP1/mTLDアイソフォームおよびプロコラーゲンIのプロセシング産物（C-プロペプチドおよびpN-コラーゲン）の有無を確認した。
   • in vitro 切断アッセイ： 精製された変異タンパク質の酵素活性を、蛍光性ペプチド、リコンビナント・ミニプロコラーゲンI、ヒト・トロンボスポンジン-1（TSP1）、およびリコンビナント・chordinに対してテストした。
   • 構造モデリング： Arg279Gly変異をAlphaFold 2を用いてモデリングし、BMP1触媒ドメインの結晶構造（PDB 6BSM）に重ね合わせ、構造的帰結を評価した。

主な結果

• 変異の特定： WESにより、胎児においてBMP1の新規なホモ接合型ミスセンス変異（c.835A>G, p.Arg279Gly）が同定された。両親はヘテロ接合型のキャリアであった。この変異はgnomADデータベースには存在しない。
• 二重の分子メカニズム：
  • スプライシング欠陥： c.835A>G変異はエキソン6の末端塩基に影響を与える。ミニジーンアッセイおよび胎児細胞からのRT-PCRにより、この変異がドナー・スプライス部位を破壊し、顕著なエキソン6・スキッピングを引き起こすことが確認された。このスキッピングはフレームシフトとエキソン7における終止コドンを引き起こし、ナンセンス変異依存mRNA分解（NMD）を誘発する可能性が高い。しかし、少量の転写産体はエキソン6を保持しており、ミスセンス変異のまま発現を可能にしていた。
  • タンパク質の不安定性／活性喪失： 胎児細胞の上清のウェスタンブロット解析では、BMP1/mTLDのタンパク質は検出されず、変異タンパク質が生成されていないか、あるいは分解されていることを示唆している。精製された変異タンパク質（Arg279Gly-FLAG）を用いたin vitroアッセイでは、プロテアーゼ活性の著しい低下が示された。変異体は、蛍光性ペプチドを切断するために、野生型と比較して2倍高い濃度を必要とした。ミニプロコラーゲンIおよびTSP1の切断は少なくとも2倍減少したが、chordinの切割は部分的に保持されていたものの、最適ではなかった。
• 臨床表現型： 胎児は、重度のIUGR、小頭症（≥3.5 SD）、頭蓋骨骨折、両側底屈足、および側頭葉低形成を含む、重篤な多奇形症的表現型を呈した。典型的な出生後のOIとは異なり、骨組織には骨粗鬆症の特徴は見られず、表現型は出生前に検出された。

意義および主張
著者らは、本症例が以下の2つの主要な点において、BMP1関連疾患の表現型のスペクトルを拡張していると主張している。

1. 出生前提示： 重篤な症候群的表現型（IUGR、小頭症、および複雑な奇形）を伴う、出生前に同定されたBMP1変異の最初の報告例である。これは、典型的な出生後の骨の脆弱性の発症とは異なる。
2. メカニズムの複雑性： 単一の塩基置換が、ミスセンス置換（プロテアーゼドメインの活性部位へのアクセシビリティに影響）と異常なスプライシングの両方を引き起こすという、二重のメカニズムを解明した。この組み合わせによる深刻な機能喪失が、出生前の致死性または重篤な罹患率を説明している。

本論文は、BMP1がchordinの切断を介したBMPシグナルの勾配調節を通じて、初期のヒト発生において、コラーゲン処理を超えた重要な役割を果たしていることを結論づけている。したがって、著者らは、重篤で早期発症の症候群的な胎児提示に対して、BMP1を出生前診断用遺伝子パネルに含めることを推奨している。彼らは、タンパク質の配列とスプライシングの両方に影響を与える変異を正確に解釈するためには、機能的検証（スプライシングおよび酵素アッセイ）が不可欠であることを強調している。