Dual-Targeting of Tumor Cells and Neovasculature for Synergistic Photoimmunotherapy: A CD105 Nanobody-Driven Nanoplatform Reprograms the Immune Microenvironment

技術要約：腫瘍細胞および新生血管の二重標的化による相乗的な光免疫療法

問題提起
固形腫瘍に対する光力学療法（PDT）と光熱療法（PTT）の併用における臨床応用は、現在、主に3つの制限事項によって阻害されている。それは、治療薬の腫瘍内蓄積の不足、標的特異性の欠如、および抗腫瘍免疫の活性化不全である。従来のナノ治療システムは、増強された透過性と保持（EPR）効果に大きく依存しているが、これは血管系が健全な初期段階の腫瘍においては信頼性が低く、健康な臓器（肝臓、脾臓など）への非特意的な蓄積を招く。さらに、従来の抗体ベースの標的化戦略は、分子量が大きく、組織浸透性が低く、免疫原性の可能性があるため、深い腫瘍コアにおける有効性が制限される。したがって、腫瘍細胞と新生血管を同時に標的とし、高密度の腫瘍マトリックスを貫通し、かつ免疫抑制的な腫瘍微小環境（TME）を再プログラミングできる精密なデリバリーシステムの開発が切実に求められている。

方法論
これらの課題に対処するため、著者らはCD105ナノボディ（Nb）で機能化された層状複水酸化物（LDH）ナノプラットフォーム、名称「CD105 Nb-LIN」を設計した。

• ナノプラットフォームの構築: 本システムは、担体として生体適合性のあるLDHナノシートを利用している。ROS生成と光熱変換の両方が可能な光増感剤であるインドシアニングリーン（ICG）をLDH層内にインターカレーションさせ、「LI」を形成した。その後、高親和性と熱安定性を備えたCD105特異的ナノボディ（Nb）を、非共有結合的な修飾を介してLIナノ粒子の表面に結合させた。
• 標的化メカニズム: CD105（エンドグリン）はTGF-β経路における共受容体であり、腫瘍新生血管内皮細胞および特定の悪性細胞において選択的に過剰発現しているが、正常組織での発現は極めて低い。CD105 Nbは、腫瘍細胞と腫瘍血管の両方に対する能動的な二重標的化を可能にする。
• 治療戦略: 本ナノプラットフォームは、相乗的なPDT/PTTのために設計されている。近赤外線（NIR）照射（808 nm）を受けると、システムは一重項酸素（$^1O_2$）と熱を生成する。極めて重要な点として、LDH担体はpH応答性を示し、酸性の腫瘍微小環境（pH < 6.5）において制御された放出とROS生成の強化を促進する。
• 免疫調節: 本研究では、ATP、カルレティキュリン（CRT）、HMGB1などの損傷関連分子パターン（DAMPs）の分泌を特徴とする免疫原性細胞死（ICD）の誘導について調査している。これは、樹状細胞（DC）の成熟と、それに続くCD8+ 細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の浸潤を駆動すると仮定されている。
• 実験モデル: 有効性は以下のモデルを用いて評価された：
  • in vitro: HepG2（肝細胞癌）、PANC-1（膵癌）、HUVEC、およびHemECを含む様々な細胞株。
  • in vivo: 直接的な抗腫瘍効果とバイオセーフティを評価するための、BALB/c ヌードマウスを用いた皮下HepG2腫瘍モデル。
  • ヒト化モデル: ヒトPBMCを再構成したNOD/SCIDマウス、およびヒトの免疫コンテキストにおける適応免疫応答を評価するための、THP-1由来未熟DCを腫瘍内注入したモデル。

主な結果

1. 材料特性評価: CD105 Nb-LINナノ粒子（~112 nm）は、ICGのインターカレーションとNbの表面結合に成功した。本システムはpH応答性の的一重項酸素生成（pH 5.0で強化）を示し、遊離ICGと比較して優れた光熱安定性を示し、複数回のレーザーサイクルにわたって有効性を維持した。
2. 標的化と取り込み: フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡により、CD105 Nb-LINが、非標的コントロールと比較して、CD105陽性細胞（HepG2、PANC-1、HemECs）において有意に高い結合および取り込みを実現することが確認された。この標的化は特異的であり、CD105陰性細胞、および組換えCD105タンパク質によってNbがブロックされた場合においても、結合が減少することから証明された。
3. 相乗的な細胞毒性: in vitro アッセイにより、CD105 Nb-LINとNIR照射の組み合わせが、強力な用量依存的な細胞毒性とアポトーシス（ミトコンドリア損傷および酸化ストレスを介したもの）を、腫瘍細胞および血管内皮細胞において誘導することが明らかになった。そのIC50は、遊離ICGまたは非標的型のLIよりも有意に低かった。
4. トランスクリプトーム解析の知見: 処理されたHepG2細胞のRNAシーケンシングにより、ストレス応答遺伝子（FOS, JUN, AP-1）の上昇と、アポトーシス経路（IL-17, TNF, MAPKシグナル伝達）の活性化が明らかになった。特筆すべきは、熱ショックタンパク質遺伝子であるHSPG2が有意にダウンレギュレーションされていたことであり、これは熱および酸化ストレスの複合的な影響下での生存メカニズムの崩壊を示唆している。
5. 免疫活性化 (in vitro): CD105 Nb-LIN処理はICDを誘発し、THP-1由来DCの成熟（CD80/CD86発現の上昇）と、共培養系における強固なCD8+ CTLの増殖を引き起こした。
6. in vivo 抗腫瘍効果: BALB/c ヌードマウスにおいて、CD105 Nb-LIN + NIR照射は、腫瘍のほぼ完全な消失と、血管新生の有意な抑制（CD31+ 血管の減少）をもたらし、全身毒性は認められなかった。組織学的検査により、広範な壊死と高いCRT発現（「私を食べろ」シグナル）が確認された。
7. ヒト化モデルの知見: ヒト免疫系を持つNOD/SCIDマウスにおいて、本治療は腫瘍内に注入されたDCの成熟を促進し、ヒトCD8+ CTLの腫瘍内浸潤を有意に増加させた。興味深いことに、DCは（治療による血管・リンパ系の損傷のためと思われるが）リンパ節へ移行することはなかったが、腫瘍部位内で直接T細胞を活性化した。これに伴い、プロ炎症性サイトカイン（hTNF-α, hIFN-γ, hIL-2）の上昇が認められ、これは「コールド」な腫瘍微小環境から「ホット」な環境への転換を示している。

意義および主張
本論文は、**「標的デリバリー–相乗的PDT/PTT–免疫活性化」**という統合的な治療パラダイムを、CD105過剰発現固形腫瘍に対して確立したと主張している。

• 二重標的化の精密性: 本研究は、CD105ナノボディが従来の抗体の限界を克服し、深い組織浸透と腫瘍細胞および新生血管の同時標的化を可能にすることを実証しており、これにより「オフターゲット」および「蓄積不足」の問題を効果的に解決している。
• 相乗的メカニズム: 本研究は、LDH担体がICGの安定性と有効性を高めるだけでなく、pH応答性のROS生成を促進し、腫瘍細胞の死滅閾値を下げる相乗効果を生み出すというメカニズム的証拠を提供している。
• in situ 免疫活性化: 本プラットフォームは、ICDを誘導し、リンパ節への移動に依存することなく腫瘍部位内で直接CD8+ T細胞を活性化することで、TMEを再プログラミングできることを示した。これは、DCの移動障壁を回避し、免疫学的に「コールド」な腫瘍を「ホット」なものへと転換するための新しい戦略を提供する。
• 安全性とトランスレーション: 本システムは、ヌードマウスおよびヒト化マウスモデルの両方において良好なバイオセーフティプロファイルを示しており、有意な臓器毒性や全身的な体重減少も見られなかった。これは、低毒性で精密な光免疫療法戦略としての潜在的な可能性を支持している。

著者らは、このナノプラットフォームが、Nb（ナノボディ）を介した腫瘍標的型光免疫療法の強固な実験的基盤を提供し、CD105発現に依存する固形悪性腫瘍の治療に向けた有望な道筋を示すものであると結論付けている。