From K-snack to copolymer: Conversion of Silkworm pupa oil into poly(3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) by engineered Cupriavidus necator H16

技術要約：エンジニアリングされた Cupriavidus necator H16 によるカイコ蛹油からの P(3HB-co-3HHx) への転換

問題提起
カイコの蛹は、韓国では伝統的に食品として消費されているが、その独特の外観や臭いにより、消費者からの受容性が低下している、養蚕業における主要な副産物である。蛹はタンパク質と脂質が豊富であるが、食品としての利用のみに依存することは、持続可能な価値向上において不十分であると考えられている。カイコ蛹油（SPO）は、脂質に富んだ残渣であり、植物油に似た脂肪酸プロファイル（オレイン酸およびリノール酸が高い）を持つが、産業利用のための原料としては未だ十分に探索されていない。同時に、生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）の商業化は、高価な炭素基質とエネルギー集約的なダウンストリーム工程に起因する高い生産コストという課題に直面している。材料特性を調整したPHAの効率的な生合成を支えることができる、低コストで再生可能かつ持続可能な炭素源を特定する必要がある。

方法論
本研究では、Pseudomonas sp. 由来の phaJ（エノイルCoAヒドラターゼ）、Rhodococcus sp. 由来の phaC（PHA 合成酵素）、および天然の phaA と phaB を発現するプラスミド pCB81 を保持する、エンジニアリングされた Cupriavidus necator H16 株を利用した。この遺伝的構成により、脂質基質からのポリ(3-ヒドロキシ酪酸-co-3-ヒドロキシアレキサノエート)［P(3HB-co-3HHx)］の生産が可能となる。

実験のワークフローは以下の通りである：

1. 基質特性評価： GC–MS 分析を行い、SPO の脂肪酸組成を決定した。
2. スクリーニングと最適化： SPO の適合性をフルクトースおよび大豆油と比較した。実験では、バイオマスおよびポリマー蓄積に対する SPO 濃度（0–3.0%）、窒素源（無機 vs 有機）、およびフルクトース共添加戦略の影響を評価した。
3. 乳化研究： SPO の疎水性に対処するため、基質の分散性と微生物へのアクセシビリティを改善することを目的として、さまざまな濃度での各種乳化剤（Tween 20、Tween 80、Tween 85、および SDS）をテストした。
4. プロセス最適化： PHA 生産を最大化するために、攪拌速度（0–300 rpm）および培養温度（25–37 °C）を最適化した。
5. 特性評価： 得られたポリマーを抽出し、フィルムを成形した後、分子量（GPC）、機械的特性（UTM）、熱挙動（DSC、TGA）、表面疎水性（接触角）、および Microbulbifer sp. SOL66 を用いた生分解性を分析した。

主な結果

• 基質の適合性： SPO は、約54% のオレイン酸、29% のリノール酸、および 17% のパルミチン酸で構成されている。フラスコ培養において、SPO はフルクトースより 2.64 倍、大豆油より 1.42 倍高いバイオマスおよび PHA コンテンツを支持した。
• 共添加戦略： 1.0% のフルクトースに 1.5% の SPO と 0.1% の尿素を補充することが最良のパフォーマンスを示した。この組み合わせにより、フルクトースが初期成長を支え、SPO がポリマー蓄積を駆動することで、SPO 単独の場合と比較して乾燥細胞重量（DCW）および総 PHA 蓄積量が最大 20% 増加した。
• 乳化： テストされた界面活性剤の中で、Tween 20（0.10–0.15%）は、より小さく均一に分散した油滴を作成することにより、DCW を 1.4 倍、PHA 収量を 1.55 倍有意に向上させた。SDS は阻害的であることが判明した。
• 生産指標： 最適化された条件（1.0% フルクトース、1.5% SPO、0.1% 尿素、300 rpm、30 °C、0.1% Tween 20）の下で、このプロセスは DCW 17.3 g/L、PHA コンテンツ 70.2%、および 3HHx モル分率 11.25%（1.63 g/L の 3HHx を生成）を達成した。
• 材料特性： SPO 由来の P(3HB-co-3HHx) フィルムは、数平均分子量（$M_n$）$9.3 \times 10^5$ Da を示した。機械的試験では、引張強度 $6.0 \pm 0.6$ MPa および破断伸度 $53.4 \pm 4.6\%$ が示された。熱分析では、融解温度（$T_m$）$163.9 \pm 2.4$ °C が示された。
• 生分解性： フィルムは、Microbulbifer sp. SOL66 と共に培養した際、7 日後に約 90% の分解が観察されるという迅速な生分解性を示した。

意義と主張
著者らは、本研究が、養蚕の副産物であるカイコ蛹油を、高付加価値バイオポリマー生産のための持続可能かつ費用対効果の高い炭素源として活用する実現可能性を示すものであると主張している。本研究は、SPO が強固な微生物増殖をサポートできるだけでなく、ホモポリマー PHB と比較して材料特性を改善した P(3HB-co-3HHx) 共重合体の合成を促進することを強調している。培養パラメータ、特にフルクトース共添加と Tween 20 による乳化の最適化を通じて、本研究は、利用されていない昆虫油を、定義された機械的および熱的特性を持つ生分解性プラスチックへと転換する経路を確立している。本研究は、低価値の農業残渣を機能的なバイオポリマー材料へと転換するという広範な目標を支持しており、それによって廃棄物管理と石油ベースのプラスチックに代わる持続可能な選択肢へのニーズの両方に対処している。