NKX2.2 is required for timely NEUROG3 extinction and segregation of competing lineage programs in human pancreatic endocrine progenitors

기술 요약: NKX2.2는 인간 췌장 내분비 전구세포의 적시 NEUROG3 소멸 및 경쟁적 계통 프로그램의 분리에 필수적이다

문제 제기
인간 다능성 줄기세포(hESCs)의 유도 분화는 췌장 내분비 전구세포를 효율적으로 생성할 수 있지만, 결과물인 세포 집단은 종종 전사적 및 기능적으로 미성숙하며, 이질성, 다호르몬 발현, 그리고 뚜렷한 단일 호르몬 세포 유형으로 분리되지 못하는 특성을 보인다. 인간에서 내분비 분화에서 안정적인 운명 결정으로 전환되는 것을 조절하는 분자적 메커니즘은 아직 완전히 정의되지 않았다. 특히, 인간에서 NKX2.2의 역할은 전구체 단계에서 명확하지 않은데, 이는 인간의 NKX2.2 발현이 마우스와 달리 NEUROG3가 정의하는 전구체 단계보다 앞서지 않고 그와 동시에 활성화되기 때문이다.

연구 방법론
저자들은 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 동형 접합 NKX2.2 결손(NKX2.2KO) 인간 배아 줄기세포 라인(MEL-1 INSGFP/w 유래)을 생성하였다. 이 라인들은 췌장 내분비 세포를 향한 검증된 다단계 2차원 프로토콜을 통해 분화되었다. 연구에는 다각적 분석 접근 방식이 사용되었다:

• 시간적 프로파일링: qPCR과 유세포 분석법을 사용하여 분화 단계 전반에 걸쳐 마커 발현(PDX1, NKX6.1, NEUROG3, CHGA, INS)을 모니터링하였다.
• 벌크 RNA 시퀀싱(Bulk RNA Sequencing): 내분비 전구체 단계(S5d4)와 최종 분화 단계(S6d14)에서 수행되어 차등 발현 유전자를 식별하였다.
• 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq): 세포 이질성을 해결하고, Slingshot을 사용하여 계통 궤적을 매핑하며, 세포 유형 비율 및 전사 상태를 분석하기 위해 S5d4 단계에서 수행되었다.
• 염색질 분석: 성인 인간 췌도에서 얻은 기존 NKX2.2 ChIP-seq 데이터를 재분석하여 scRNA-seq 데이터와 통합함으로써, NKX2.2 점유율과 염색질 상태(활성/비활성 인핸서, 프로모터) 간의 상관관계를 파악하고 전사 결과를 예측하였다.
• 면역형광 염색: 단백질 발현을 검증하고, 호르몬 생산(인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린)을 평가하며, 다호르몬 세포를 검출하는 데 사용되었다.

주요 기여 및 결과

1. NKX2.2는 내분비 분화에는 불필요하지만 운명 결정에는 필수적이다:

   • 인간 hESC 유래 세포에서 NKX2.2 발현은 마우스의 경우와 달리 내분비 전구체(EP) 단계 동안 NEUROG3와 동시에 유도된다.
   • NKX2.2KO 세포에서는 내분비 계통의 초기 분화가 정상적으로 발생한다: 즉, NEUROG3가 유도되며, 야생형(WT)과 유사한 빈도로 CHGA+ 세포가 생성된다.
   • 그러나 KO 세포는 성숙한 단일 호르몬 운명으로 분리되는 데 실패한다. 최종 단계(S6d14)에서 KO 배양물은 인슐린+ 세포의 심각한 감소(~88% 대비 ~20%)를 보이며, 소마토스타틴+ 및 그렐린+ 세포의 유의미한 증가, 그리고 대규모의 호르몬 음성 또는 다호르몬 세포를 나타낸다.

2. 전구체 프로그램의 소멸 및 계통 갈등 해결 실패:

   • 지속적인 NEUROG3: 단일 세포 분석 결과, 정상적으로는 일시적이어야 하는 NEUROG3 발현이 NKX2.2KO 세포에서는 소멸되지 않고 지속됨이 밝혀졌다. NEUROG3는 헌신된 전구체 집단(Beta_prog, Alpha_prog) 및 미성숙 내분비 세포에서 계속 높게 유지되며, 이는 전구체 상태로부터의 탈출 실패를 나타낸다.
   • 상호 배타적 프로그램의 공동 활성화: 야생형 세포에서 ARX(알파 세포 결정 인자)와 PAX4(베타 세포 결정 인자)는 상호 배타적이다. NKX2.2KO 세포에서는 모든 내분비 구획 내의 동일한 개별 세포 내에서 ARX와 PAX4의 광범위한 공동 활성화가 관찰된다. 이러한 경쟁적 계통 프로그램의 분리 실패는 다호르몬 세포의 출현과 상관관계가 있다.
   • 궤적 정체: 의사 시간(Pseudotime) 분석은 NKX2.2KO 세포가 분화의 중간 단계에 축적되며 $\beta$, $\delta$, $\alpha$ 궤적의 확정된 끝단으로 진행하지 못함을 보여준다. 상당 부분의 KO 세포가 $\alpha$ 및 $\epsilon$ 계통이 갈라지기 전의 공유된 궤적에 머물러 있다.

3. 염색질 맥락이 NKX2.2의 기능을 결정한다:

   • NKX2.2 ChIP-seq 데이터 재분석 결과, NKX2.2 점유율 자체는 전사의 방향성을 예측하지 못했다. 대신, 결합된 요소의 염색질 상태가 예측 지표가 되었다:
     • 활성 인핸서/프로모터에 결합하는 경우, 결손(KO) 시 유전자 발현이 감소함(예: NKX6-1, FEV). 이는 NKX2.2가 이러한 맥락에서 특정 운명을 유지하거나 대안적 운명을 억제하는 억제제로 작용함을 시사한다.
     • 비활성 인핸서에 결합하는 경우, 결손(KO) 시 유전자 발현이 증가함(예: NEUROG3, ARX). 이는 NKX2.2가 전구체 프로그램의 적시 소멸을 보장하기 위해 해당 로커스(loci)를 직접 억제함을 시사한다.
   • 이 모델은 NKX2.2 부재 시 NEUROG3(비활성 인핸서에 결합)의 상향 조절과 NKX6-1(활성 인핸서에 결합)의 하향 조절을 설명한다.

4. 특이적 계통 결함:

   • $\beta$-세포: 최종 결정 인자(NKX6-1, INS)의 유도 실패 및 전구체 마커의 지속적 발현.
   • $\alpha$-세포: ARX는 유도되지만, 하위 성숙 마커(IRX2, GCG)의 상향 조열이 실패함.
   • $\delta$-세포: 최종 단계에서 SST 발현이 증가하지만, 이는 완전한 $\delta$-세포 전사 프로그램(예: POU2F2 미유도) 없이 발생하며, 이는 이들이 진정한 $\delta$-세포 확장이라기보다 해결되지 않은 정체성을 가진 세포임을 시사한다.
   • $\epsilon$-세포: 마우스 및 인간 환자 데이터와 일치하게 그렐린 발현 $\epsilon$-유사 집단의 진정한 확장이 관찰되나, 이 세포들 또한 조절되지 않은 초기 전사 인자(PAX4, ARX)를 나타낸다.

의의
본 논문은 NKX2.2가 인간 내분비 계통의 초기 *분화(specification)*에는 필요하지 않지만, 이후의 내분비 운명 *결정(resolution)*에는 필수적이라고 결론짓는다. NKX2.2의 주요 역할은 전구체 프로그램(특히 NEUROG3)의 적시 소멸을 보장하고, 경쟁하는 계통 프로그램(특히 상호 배타적인 ARX와 PAX4 네트워크)의 분리를 강제하는 것이다. 연구는 현재의 줄기세포 유래 췌도 프로토콜에서 관찰되는 이질성과 미성숙함이 이러한 운명 결정 단계의 실행 실패에서 기인할 수 있다고 제안한다. 본 연구의 결과는 인슐린 손실 및 그렐린 상승에 관한 마우스 및 인간 환자 데이터와 일치하지만, 소마토스타틴 세포의 특이적 확장은 인간 분화 맥락이나 특정 프로토콜에 고유한 현상일 수 있음을 언급한다. 저자들은 내분비 세포를 단순히 생성하는 것을 넘어, 전구체 프로그램을 소멸시키고 계통 특이적 정체성을 안정화하는 전략을 실행하는 것이 줄기세포 유래 내분비 세포 집단의 충실도를 높이는 데 필요하다고 주장한다.