NKX2.2 is required for timely NEUROG3 extinction and segregation of competing lineage programs in human pancreatic endocrine progenitors

技術要約：ヒト膵臓内分泌前駆細胞における、NEUROG3の適時な消去と競合する系統プログラムの分離にNKX2.2が必要であること

問題提起
ヒト多能性幹細胞（hESC）からの指向性分化は、膵臓内分泌前駆細胞を効率的に生成できる一方で、得られる細胞集団はしばしば転写学的および機能的に未熟であり、不均一性、ポリホルモン発現、および明確な単一ホルモン細胞へと分化・解決できないという特徴を持つ。ヒトにおいて、内分泌への特定から安定した運命決定へと移行する分子メカニズムは完全には定義されていない。特に、ヒトにおけるNKX2.2の役割は、内分泌前駆細胞段階におけるヒトのNKX2.2発現が、マウスのように前段階ではなく、NEUROG3によって定義される前駆細胞状態と同時に活性化されることから、依然として不明な点が多い。

方法論
著者らは、CRISPR/Cas9システムを利用して、ホモ接合型NKX2.2欠損（NKX2.2KO）ヒト胚性幹細胞ライン（MEL-1 INSGFP/w 由来）を作製した。これらのラインを、検証済みの多段階・二次元プロトコルを用いて膵臓内分泌細胞へと分化させた。研究では以下のマルチモーダル解析手法を用いた：

• 経時的プロファイリング： 定量的PCR（qPCR）およびフローサイトメトリーを用い、分化段階におけるマーカー発現（PDX1, NKX6.1, NEUROG3, CHGA, INS）をモニタリングした。
• バルクRNAシーケンシング： 内分泌前駆細胞段階（S5d4）および終末分化段階（S6d14）において実施し、発現変動遺伝子を同定した。
• シングルセルRNAシーケンシング（scRNA-seq）： S5d4において細胞の不均一性を解明し、Slingshotを用いて系統の軌跡（リネージ・トラジェトリー）をマッピングし、細胞型比率および転写状態を解析した。
• クロマチン解析： 成人ヒト膵島からの既存のNKX2.2 ChIP-seqデータの再解析を行い、scRNA-seqデータと統合することで、NKX2.2の占有部位とクロマチン状態（活性/不活性エンハンサー、プロモーター）を相関させ、転写の結果を予測した。
• 免疫蛍光染色： タンパク質発現、ホルモン産生（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン）、およびポリホルモン細胞の検出を検証するために用いた。

主要な貢献および結果

1. NKX2.2は内分泌への特定には不要であるが、運命の解決には必要である：

   • ヒトhESC由来細胞におけるNKX2.2の発現は、マウスで見られるような先行的な発現とは異なり、内分泌前駆細胞（EP）段階においてNEUROG3と同時に誘導される。
   • NKX2.2KO細胞においても、内分泌系統への初期の特定は正常に行われる：NEUROG3が誘導され、野生型と同程度の頻度でCHGA陽性細胞が生成される。
   • しかし、KO細胞は成熟した単一ホルモン運命へと解決することに失敗する。終末段階（S6d14）までに、KO培養物ではインスリン陽性細胞が激減し（野生型の88%に対し約20%）、ソマトスタチン陽性およびグレリン陽性細胞が有意に増加し、大量のホルモン陰性またはポリホルモン細胞が出現する。

2. 前駆細胞プログラムの消去と系統間の競合解決の失敗：

   • 持続的なNEUROG3： シングルセル解析により、通常は一過性であるNEUROG3の発現が、NKX2.2KO細胞では消去されないことが明らかになった。NEUROG3は、コミットされた前駆細胞集団（Beta_prog, Alpha_prog）および未熟な内分泌細胞において高発現のまま維持されており、これは前駆細胞状態からの脱出の失敗を示している。
   • 相互排他的なプログラムの共活性化： 野生型細胞では、ARX（α細胞特異的因子）とPAX4（β細胞特異的因子）は相互に排他的である。NKX2.2KO細胞では、すべての内分泌コンパートメントにおいて、同一の個々の細胞内でARXとPAX4の広範な共活性化が見られる。この競合する系統プログラムの分離失敗は、ポリホルモン細胞の出現と相関している。
   • 軌跡の停滞： 擬時間（Pseudotime）解析によれば、NKX2.2KO細胞は分化の中間段階に蓄積し、β、δ、およびαの各軌跡の終着点へと進行できない。KO細胞の大部分は、αおよびε系統が分岐する前の共通の軌跡上に留まっている。

3. クロマチン環境がNKX2.2の機能を規定する：

   • NKX2.2のChIP-seqデータの再解析により、NKX2.2の占有のみでは転写の方向性は予測できないことが示された。代わりに、結合した要素のクロマチン状態が予測因子となる：
     • 活性エンハンサー/プロモーターへの結合は、ノックアウト（KO）時における遺伝子のダウンレギュレーション（例：NKX6-1, FEV）と関連しており、これはNKX2.2が特定の運命を維持するか、あるいは代替の運命を抑制するために、これらの文脈でリプレッサー（抑制因子）として機能することを示唆している。
     • 不活性エンハンサーへの結合は、KO時における遺伝子のアップレギュレーション（例：NEUROG3, ARX）と関連しており、これはNKX2.2が前駆細胞プログラムの適時な消去を確実にするために、これらの遺伝子座を直接抑制していることを示唆している。
   • このモデルは、NKX2.2の欠損に伴うNEUROG3（不活性エンハンサーに結合）の上昇と、NKX6-1（活性エンハンサーに結合）の低下を説明するものである。

4. 特異的な系統欠陥：

   • β細胞： 終末特異的因子（NKX6-1, INS）の誘導失敗、および前駆細胞マーカーの持続的発現。
   • α細胞： ARXは誘導されるものの、下流の成熟マーカー（IRX2, GCG）の上昇に失敗する。
   • δ細胞： 終末段階でSSTの発現が増加するが、これは完全なδ細胞転写プログラム（例：POU2F2の誘導）を伴わない。これは、真のδ細胞の拡大ではなく、未解決のアイデンティティを持つ細胞であることを示唆している。
   • ε細胞： マウスおよびヒト患者のデータと一致する、グレリン発現ε様集団の真の拡大が見られるが、これらの細胞もまた、調節不全な初期転写因子（PAX4, ARX）を呈している。

意義
本論文は、NKX2.2はヒトの内分泌系統の初期の「特定」には必要ではないが、その後の内分泌運命の「解決」には不可欠であると結論付けている。その主な役割は、前駆細胞プログラム（特にNEUROG3）の適時な消去を確実にすること、および競合する系統プログラム（特に相互排他的なARXとPAX4ネットワーク）の分離を強制することである。本研究は、現在の幹細胞由来膵島プロトコルで見られる不均一性と未熟性は、この「解決」ステップの実行失敗に起因している可能性があると指摘している。これらの知見は、幹細胞由来の内分泌集団の忠実度を高めるためには、単に内分泌へのコミットメントを生成するだけでなく、前駆細胞プログラムの消去と系統固有のアイデンティティの安定化を促進する戦略が必要であることを示唆している。著者らは、インスリンの喪失やグレリンの上昇に関する彼らの知見はマウスおよびヒト患者のデータと一致しているものの、ソマトスタチン細胞の特異的な拡大については、ヒトの分化コンテキストまたは使用された特定のプロトコルに固有のものである可能性があると述べている。