G-quadruplex structures act as a novel recognition motif for the meiosis-specific histone methyltransferase PRDM9

기술 요약: G-quadruplex 구조는 PRDM9 메이오시스 특이적 히스톤 메틸트랜스퍼레이즈의 새로운 인식 모티프로서 작용한다

문제 제기
히스톤 메틸트랜스퍼레이즈인 PRDM9은 인간을 포함한 대부분의 포유류에서 감수 분열 재조합 핫스팟 위치를 결정하는 주요 결정 인자이다. PRDM9은 C-터미널 아연 집게(zinc-finger, ZnF) 어레이를 통해 특정 퇴화된 DNA 서열 모티프에 결합하고, H3K4me3 및 H3K36me3 히스톤 표지를 침착시켜 이중 가닥 절단(double-strand break, DSB) 기구를 모집함으로써 기능한다. 그러나 현재 PRDM9 기능에 대한 이해의 중요한 한계는, 단일한 일차 DNA 서열 모티프만으로는 게놈 전반의 점유율을 완전히 설명할 수 없다는 점이다. PRDM9이 결합하는 많은 핫스팟들은 인식 가능한 컨센서스 서열이 결여되어 있으며, PRDM9 결합 부위 중 일부는 재조합 이벤트가 일반적으로 결핍된 프로모터 관련 영역 및 CpG 아일랜드에서 발생한다. 또한, PRDM9 ZnF 어레이의 급격한 진화는 고유한 모티프 특이성을 가진 새로운 대립유전자를 생성하지만, 단순한 서열 인식을 넘어 핫스팟 선택을 조절하는 메커니즘은 여전히 불분명하다. 저자들은 DNA 이차 구조, 특히 PRDM9의 C-rich 결합 모티프와 상보적인 G-rich 영역에서 형성되는 G-quadruplex(G4)가 PRDM9 모집을 용이하게 하는 추가적인 인식 플랫폼 역할을 할 것이라고 가설을 세웠다.

방법론
본 연구는 대규모 생물정보학 분석과 in vitro 생화학적 분석을 결합한 다각적인 접근 방식을 채택하였다:

1. 컴퓨터 및 게놈 분석:

   • 데이터 통합: 저자들은 동일한 세포주 내에서 PRDM9-B를 과발현시킨 HEK293 세포로부터 얻은 PRDM9 ChIP-seq 데이터와 BG4 항체 기반 CUT&Tag 데이터(G4 구조 특이적)를 통합하였다.
   • 농축 분석: 저자들은 매칭된(길이, GC 함량, 엔트로피를 제어함) 및 글로벌 배경 게놈 윈도우와 비교하기 위해 PRDM-binding 사이트를 분석하는 파이프라인을 개발하였다. 분석된 특징에는 G4 모티프(pqsfinder로 예측되고 BG4 CUT&Tag로 검증됨), 히스톤 표지(H3K4me3, H3K36me3), DNA 메틸화, 염색질 접근성(ATAC-seq), 그리고 알려진 재조합 핫스팟과의 근접성이 포함되었다.
   • 계층화: G4 모티프는 안정성 점수(사분위수), 루프 길이(짧음, 중간, 길음), 서열 구조(정형 vs 비정형), 그리고 실험적 지원 여부(검증됨 vs 예측됨)에 따라 계층화되었다.

2. 생화학적 분석 (EMSA):

   • 단백질 준비: 인간 PRDM9-A(유럽의 주요 대립유전자)의 전체 길이를 eYFP와 융합하여 HEK293 세포에서 일시적으로 과발현시켰다. 단백질의 천연 폴딩과 ZnF 어레이의 무결성을 보존하기 위해 전체 세포 추출물을 준비하였다.
   • DNA 기질:
     • dsDNA: PRDM9 모티프와 중첩된 G4를 포함하는 두 개의 잘 특성화된 재조합 핫스팟(PCP4의 HSI 및 RBFOX1의 HSII)을 포함하는 생체 인식된(biotinylated) PCR 단편.
     • ssDNA G4s: 핫스팟에서 유래한 짧은 생체 인식된 올리고뉴클레오타이드, 인공 G4 서열(인간 게놈에는 존재하지 않음), 그리고 G4 형성을 방해하도록 설계된 변이체.
   • 전기영동 이동성 변화 분석 (EMSA): 결합 반응은 다양한 KCl 농도(50 mM vs 150 mM)와 G4 안정화 리간드인 피리도스타틴(pyridostatin, PDS)의 첨가를 통해 G4 안정성을 조절하며 TKZN 버퍼에서 수행되었다. 결합은 화학 발광을 통해 시각화되었다.
   • 구조 검증: 원형 이색 편광(Circular Dichroism, CD) 분광법과 용해 곡선 분석을 사용하여 실험 조건 하에서의 G4 구조 형성 및 열적 안정성을 확인하였다.

주요 기여 및 결과

1. PRDM9 사이트에서의 G4 게놈 농축:

   • 컴퓨터 분석 결과, G4 모한은 정형적인 PRDM9 서열 모티프 및 히스톤 표지와 유사하게 PRDM9 결합 사이트에서 가장 농축된 특징 중 하나임이 밝혀졌다.
   • 결정적으로, 이러한 농축은 예측된 G4보다 실험적으로 검증된 G4(BG4 CUT&Tag에 의해 검출됨)에서 훨씬 더 강력하게 나타났다. 이는 연관성이 단순히 G-rich 서열 잠재력이 아닌 물리적 구조에 의해 구동됨을 시사한다.
   • 안정성 및 정형 구조: 높은 안정성을 가진 G4(pqsfinder 점수의 상위 사분위수)와 정형 G4 모티프가 가장 강한 농축을 보였다. 비정형 G4 및 덜 안정적인 구조는 현저히 낮은 농축을 나타냈다.
   • 염색질 맥락: 안정적인 검증된 G4와 중첩되는 PRDM9 결합 사이트는 G4가 없는 사이트에 비해 유의미하게 높은 기존 염색질 접근성(ATAC-seq 신호)을 보였으며, 이는 G4가 PRDM9 결합 전의 접근 가능한 염색질 영역을 표시하거나 유지할 수 있음을 시사한다.

2. G4 구조에 대한 PRDM9의 직접 결합:

   • dsDNA 결합: PRDM9 추출물은 PRDM9 모티프와 중첩된 G4를 포함하는 재조합 핫스팟(HSI 및 HSII)의 dsDNA 단편에 성공적으로 결합하였다.
   • ssDNA G4 결합: PRDM9은 단일 가닥 G4 형성 올리고뉴클레오타이드에 직접 결합하였다. 결합 친화도는 G4 안정성과 상관관계가 있었다:
     • 매우 안정적인 HSI-G4(점수 89)는 강한 결합을 보인 반면, 덜 안정적인 HSII-G4(점수 29)는 약한 결합을 보였다.
     • KCl 농도를 높여(G4 안정화) PDS를 추가하면 안정적인 G4(Q4 모티프)에 대한 PRDM9 결합은 크게 향상되었으나, 불안정한 G4(Q1 모티프)에는 영향이 미미했다.
   • 인공 G4 인식: PRDM9은 (인간 게놈에는 존재하지 않는) 안정적인 하이브리드 토폴로지를 형성하는 인공 G4 서열에 결합하였다. 이 서열을 돌연변이시켜 G4 형성을 방지하자 결합이 사라졌으며, 이는 PRDM9이 특정 일차 서열 맥락과 독립적으로 이차 구조 자체를 인식함을 확인시켜 준다.

3. 경쟁적 결합:

   • 경쟁 EMSA에서 안정적인 G4 올리고뉴클레오타이드는 정형 dsDNA 핫스팟 단편과 PRDM9 결합을 효과적으로 경쟁하였다. 덜 안정적인 G4는 감소된 경쟁 능력을 보였으며, 이는 구조적 안정성과 인식 사이의 연결을 강화한다.

의의 및 주장
저자들은 안정적인 G-quadruplex 구조가 정형적인 서열 특이적 아연 집게 결합과 함께 PRDM9의 새로운 인식 모티프로서 작용한다는 모델을 제안한다. 본 논문은 다음과 같이 주장한다:

• 구조적 인식: PRDM9은 단순한 일차 DNA 서열뿐만 아니라 G4 이차 구조를 직접 인식하고 결합할 수 있다.
• 안정성 의존성: 이러한 인식의 효율성은 G4 구조의 열역학적 안정성에 엄격하게 의존하며, 매우 안정적인 G4가 우선적으로 결합된다.
• 핫스팟 지정 메커니즘: 안정적인 G4는 별도의 접근 가능한 염색질 환경을 생성하거나 유지함으로써 PRDM9의 모집을 용이하게 할 가능성이 크다. 이는 PRDM9이 일차 서열 모티프가 최적이 아니거나 컨센서스 모티프가 결여된 부위에서도 특정 로커스(loci)를 타겟팅할 수 있는 메커니즘을 제공한다.
• 진화적 함의: 본 연구는 G4 안정성의 변화(예: SNP rs74149540)가 PRDM9 결합 친화도 및 핫스팟 활성을 조절하여, 재조합 핫스팟의 역동적인 전환과 집단 특이적 재조합 경관에 기여할 수 있음을 시사한다.

본 논문은 DNA 이차 구조가 메이오시스 재조합을 조절하는 추가적인 정보 층을 구성하며, 이는 PRDM9 점유율과 컨센서스 모티프가 없는 부위 사이의 관계를 설명하고 프로모터 관련 영역에서의 PRDM9 결합 농축을 설명하는 틀을 제공한다고 결론짓는다. 저자들은 본 연구가 in vitro 분석 및 컴퓨터 예측에 의존하고 있음을 언급하며, in vivo에서의 DSB 형성에 대한 G4 인식의 인과적 역할을 확립하기 위해 향후 연구가 필요함을 인정하였다.