G-quadruplex structures act as a novel recognition motif for the meiosis-specific histone methyltransferase PRDM9

Resumo Técnico: Estruturas de G-quadruplex atuam como um novo motivo de reconhecimento para a metiltransferase de histonas específica da meiose PRDM9

Definição do Problema
A metiltransferase de histona PRDM9 é o principal determinante dos locais de hotspots de recombinação meiótica na maioria dos mamíferos, incluindo humanos. Ela funciona ligando-se a motivos de sequência de DNA degenerados via seu arranjo de dedos de zinco (ZnF) C-terminais e depositando marcas de H3K4me3 e H3K36me3 para recrutar a maquinaria de quebra de fita dupla (DSB). No entanto, uma limitação significativa no entendimento atual da função da PRDM9 é que o motivo de sequência primária de DNA sozinho não pode explicar totalmente sua ocupação em todo o genoma. Muitos hotspots ligados à PRDM9 carecem de sequências consenso reconhecíveis, e um subconjunto dos sítios de ligação da PRDM9 ocorre em regiões associadas a promotores e ilhas CpG, que são tipicamente desprovidas de eventos de recombinação. Além disso, a evolução rápida do arranjo ZnF da PRDM9 gera novos alelos com especificidades de motivo distintas, mas os mecanismos que governam a seleção de hotspots além do simples reconhecimento de sequência permanecem obscuros. Os autores hipotetizam que estruturas secundárias de DNA, especificamente G-quadruplexes (G4s), que se formam em regiões ricas em G complementares aos motivos de ligação ricos em C da PRDM9, podem servir como uma plataforma de reconhecimento adicional facilitando o recrutamento da PRDM9.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem multifacetada combinando análise bioinformática de larga escala com ensaios bioquímicos in vitro:

1. Análise Computacional e Genômica:

   • Integração de Dados: Os autores integraram dados de ChIP-seq de PRDM9 (de células HEK293 superexpressando PRDM9-B) com dados de CUT&Tag baseados no anticorpo BG4 (específico para estruturas G4) na mesma linhagem celular.
   • Análise de Enriquecimento: Eles desenvolveram um pipeline para comparar os sítios de ligação da PRDM9 contra janelas genômicas de fundo correspondentes (controlando por comprimento, conteúdo GC e entropia) e globais. As características analisadas incluíram motivos G4 (preditos por pqsfinder e validados por BG4 CUT&Tag), marcas de histonas (H3K4me3, H3K36me3), metilação do DNA, acessibilidade da cromatina (ATAC-seq) e proximidade com hotspots de recombinação conhecidos.
   • Estratificação: Os motivos G4 foram estratificados por escores de estabilidade (quartis), comprimento de loop (curto, médio, longo), arquitetura de sequência (canônica vs. não canônica) e suporte experimental (validado vs. predito).

2. Ensaios Bioquímicos (EMSA):

   • Preparação de Proteína: A PRDM9-A humana de comprimento total (o alelo europeu predominante) fundida a eYFP foi transientemente superexpressa em células HEK293. Extratos de células inteiras foram preparados para preservar a dobra nativa da proteína e a integridade do arranjo ZnF.
   • Substratos de DNA:
     • dsDNA: Fragmentos de PCR biotinilados cobrindo dois hotspots de recombinação bem caracterizados (HSI em PCP4 e HSII em RBFOX1) contendo motivos PRDM9 e G4s sobrepostos.
     • ssDNA G4s: Oligonucleotídeos curtos biotinilados representando motivos G4 de hotspots, sequências G4 artificiais (não encontradas no genoma humano) e variantes mutadas projetadas para interromper a dobra G4.
   • Ensaios de Mobilidade Eletroforética (EMSA): As reações de ligação foram conduzidas em tampão TKZN com concentrações variadas de KCl (50 mM vs. 150 mM) e a adição do ligante estabilizador de G4 piridostatina (PDS) para modular a estabilidade do G4. A ligação foi visualizada via quimioluminescência.
   • Validação Estrutural: Espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) e análises de curva de fusão foram utilizadas para confirmar a formação das estruturas G4 e sua estabilidade térmica sob condições experimentais.

Principais Contribuições e Resultados

1. Enriquecimento Genômico de G4s em Sítios de PRDM9:

   • A análise computacional revelou que os motivos G4 estão entre as características mais enriquecidas nos sítios de ligação da PRDM9, comparáveis ao enriquecimento do motivo de sequência canônico da PRDM9 e das marcas de histonas.
   • Crucialmente, esse enriquecimento foi significativamente maior para G4s experimentalmente validados (detectados por BG4 CUT&Tag) do que para G4s computacionalmente preditos sem suporte experimental. Isso sugere que a associação é impulsionada pela estrutura física e não apenas pelo potencial de sequência rica em G.
   • Estabilidade e Estrutura Canônica: G4s altamente estáveis (quartil superior de escores do pqsfinder) e motivos G4 canônicos mostraram o enriquecimento mais forte. G4s não canônicos e estruturas menos estáveis exibiram enriquecimento substancialmente mais fraco.
   • Contexto de Cromatina: Sítios de ligação de PRDM9 que sobrepõem G4s estáveis e validados mostraram significativamente maior acessibilidade pré-existente da cromatina (sinal ATAC-seq) em comparação com sítios sem G4s, sugerindo que os G4s podem marcar ou manter regiões de cromatina acessíveis antes da ligação da PRDM9.

2. Ligação Direta de PRDM9 a Estruturas G4:

   • Ligação a dsDNA: Extratos de PRDM9 ligaram-se com sucesso a fragmentos de dsDNA de hotspots de recombinação (HSI e HSII) contendo motivos PRDM9.
   • Ligação a ssDNA G4: A PRDM9 ligou-se diretamente a oligonucleotídeos de formação G4 de fita simples. A afinidade de ligação correlacionou-se com a estabilidade do G4:
     • O HSI-G4 altamente estável (escore 89) mostrou forte ligação, enquanto o HSII-G4 menos estável (escore 29) mostrou ligação fraca.
     • O aumento da concentração de KCl (estabilizando os G4s) e a adição de PDS aumentaram significativamente a ligação da PRDM9 aos G4s estáveis (motivo Q4), mas tiveram efeito mínimo nos G4s instáveis (motivo Q1).
   • Reconhecimento de G4 Artificial: A PRDM9 ligou-se a uma sequência G4 artificial (não presente no genoma humano) que formou uma topologia híbrida estável. A mutação dessa sequência para impedir a formação de G4 aboliu a ligação, confirmando que a PRDM9 reconhece a própria estrutura secundária, independentemente do contexto específico da sequência primária.

3. Ligação Competitiva:

   • Nos EMSAs de competição, oligonucleotídeos G4 estáveis competiram efetivamente com fragmentos de hotspot de dsDNA canônicos pela ligação à PRDM9. G4s menos estáveis mostraram capacidade competitiva reduzida, reforçando a ligação entre estabilidade estrutural e reconhecimento.

Significância e Alegações
Os autores propõem um modelo onde as estruturas de G-quadruplex estáveis atuam como um novo motivo de reconhecimento para a PRDM9, funcionando juntamente com a ligação de dedos de zinco específica de sequência canônica. O artigo afirma que:

• Reconhecimento Estrutural: A PRDM9 pode reconhecer e ligar-se diretamente a estruturas secundárias G4, não apenas à sequência de DNA primária.
• Dependência de Estabilidade: A eficiência desse reconhecimento é estritamente dependente da estabilidade termodinâmica da estrutura G4; G4s altamente estáveis são preferencialmente ligados.
• Mecanismo de Especificação de Hotspot: G4s estáveis provavelmente facilitam o recrutamento da PRDM9 ao criar ou manter ambientes de cromatina discretos e acessíveis. Isso fornece um mecanismo para a PRDM9 visar loci específicos mesmo quando o motivo de sequência primária é suboptimal ou quando o sítio carece de um motivo consenso.
• Implicações Evolutivas: O estudo sugere que variações na estabilidade de G4 (por exemplo, devido a SNPs como rs74149540) poderiam modular a afinidade de ligação da PRDM9 e a atividade dos hotspots, contribuindo para a rotatividade dinâmica dos hotspots de recombinação e para as paisagens de recombinação específicas de populações.

O artigo conclui que a estrutura secundária do DNA constitui uma camada adicional de informação regulando a recombinação meiótica, oferecendo uma estrutura para reconciliar a ocupação da PRDM9 em sítios que carecem de motivos consenso e explicar o enriquecimento da ligação da PRDM9 em regiões associadas a promotores. Os autores reconhecem limitações, observando que o estudo depende de ensaios in vitro e predições computacionais, e que trabalhos futuros são necessários para estabelecer o papel causal do reconhecimento de G4 na formação de DSB in vivo.