G-quadruplex structures act as a novel recognition motif for the meiosis-specific histone methyltransferase PRDM9

Resumen Técnico: Las estructuras de G-cuádruplex actúan como un nuevo motivo de reconocimiento para la metiltransferasa de histonas específica de la meiosis PRDM9

Planteamiento del problema
La metiltransferasa de histonas PRDM9 es el determinante principal de la localización de los puntos calientes (hotspots) de recombinación meiótica en la mayoría de los mamíferos, incluidos los humanos. Funciona uniéndose a motivos de secuencias de ADN degeneradas específicas mediante su arreglo de dedos de zinc (ZnF) C-terminal y depositando marcas de histonas H3K4me3 y H3K36me3 para reclutar la maquinaria de rotura de doble cadena (DSB). Sin embargo, una limitación significativa en la comprensión actual de la función de PRDM9 es que el motivo de secuencia primaria de ADN por sí solo no puede explicar completamente su ocupación en todo el genoma. Muchos puntos calientes unidos por PRDM9 carecen de secuencias consenso reconocibles, y un subconjunto de los sitios de unión de PRDM9 ocurre en regiones asociadas a promotores e islas CpG, las cuales suelen estar desprovistas de eventos de recombinación. Además, la rápida evolución del arreglo ZnF de PRDM9 genera nuevos alelos con especificidades de motivo distintas, pero los mecanismos que gobiernan la selección de los puntos calientes más allá del simple reconocimiento de secuencias siguen sin estar claros. Los autores plantean la hipótesis de que las estructuras secundarias de ADN, específicamente los G-cuádruplex (G4), que se forman en regiones ricas en guanina (G) complementarias a los motivos de unión ricos en citosina (C) de PRDM9, pueden servir como una plataforma de reconocimiento adicional que facilita el reclutamiento de PRDM9.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multifacético que combinó el análisis bioinformático a gran escala con ensayos bioquímicos in vitro:

1. Análisis computacional y genómico:

   • Integración de datos: Los autores integraron datos de ChIP-seq de PRDM9 (de células HEK293 que sobreexpresan PRDM9-B) con datos de CUT&Tag basados en el anticuerpo BG4 (específico para estructuras G4) en la misma línea celular.
   • Análisis de enriquecimiento: Desarrollaron un flujo de trabajo para comparar los sitios de unión de PRDM9 frente a ventanas genómicas de fondo emparejadas (controlando por longitud, contenido de GC y entropía) y globales. Las características analizadas incluyeron motivos G4 (predichos por pqsfinder y validados por CUT&Tag de BG4), marcas de histonas (H3K4me3, H3K36me3), metilación del ADN, accesibilidad de la cromatina (ATAC-seq) y proximidad a puntos calientes de recombinación conocidos.
   • Estratificación: Los motivos G4 se estratificaron por puntuaciones de estabilidad (cuartiles), longitud de bucle (corto, medio, largo), arquitectura de secuencia (canónica vs. no canónica) y soporte experimental (validado vs. predicho).

2. Ensayos bioquímicos (EMSA):

   • Preparación de proteínas: Se sobreexpresó transitoriamente la proteína humana PRDM9-A (el alelo predominante europeo) fusionada a eYFP en células HEK293. Se prepararon extractos de células completas para preservar el plegamiento nativo de la proteína y la integridad del arreglo ZnF.
   • Sustratos de ADN:
     • dsDNA: Fragmentos de PCR biotinilados que cubren dos puntos calientes de recombinación bien caracterizados (HSI en PCP4 y HSII en RBFOX1) que contienen motivos de PRDM9 y G4s superpuestos.
     • ssDNA G4s: Oligonucleótidos cortos biotinilados que representan motivos G4 de los puntos calientes, secuencias G4 artificiales (no presentes en el genoma humano) y variantes mutadas diseñadas para interrumpir el plegamiento de G4.
   • Ensayos de retardo en gel de electroforesis (EMSA): Las reacciones de unión se llevaron a cabo en tampón TKZN con concentraciones variables de KCl (50 mM vs. 150 mM) y la adición del ligando estabilizador de G4, piridostatina (PDS), para modular la estabilidad de los G4. La unión se visualizó mediante quimioluminiscencia.
   • Validación estructural: Se utilizaron espectroscopía de dicroísmo circular (CD) y análisis de curvas de fusión para confirmar la formación de las estructuras G4 y su estabilidad térmica bajo las condiciones experimentales.

Contribuciones clave y resultados

1. Enriquecimiento genómico de G4 en los sitios de PRDM9:

   • El análisis computacional reveló que los motivos G4 se encuentran entre las características más enriquecidas en los sitios de unión de PRDM9, comparables al enriquecimiento del motivo de secuencia canónico de PRDM9 y las marcas de histonas.
   • Crucialmente, este enriquecimiento fue significativamente más fuerte para los G4 validados experimentalmente (detectados por CUT&Tag de BG4) que para los G4 predichos computacionalmente que carecen de soporte experimental. Esto sugiere que la asociación está impulsada por la estructura física más que por el simple potencial de la secuencia rica en G.
   • Estabilidad y estructura canónica: Los G4 altamente estables (cuartil superior de las puntuaciones de pqsfinder) y los motivos G4 canónicos mostraron el mayor enriquecimiento. Los G4 no canónicos y las estructuras menos estables exhibieron un enriquecimiento sustancialmente más débil.
   • Contexto de la cromatina: Los sitios de unión de PRDM9 que se superponen con G4 estables y validados mostraron una accesibilidad de la cromatina preexistente significativamente mayor (señal ATAC-seq) en comparación con los sitios sin G4, lo que sugiere que los G4 pueden marcar o mantener regiones de cromatina accesibles antes de la unión de PRDM9.

2. Unión directa de PRDM9 a las estructuras G4:

   • Unión a dsDNA: Los extractos de PRDM9 se unieron con éxito a fragmentos de dsDNA de puntos calientes de recombinación (HSI y HSII) que contienen motivos de PRDM9.
   • Unión a ssDNA G4: PRDM9 se unió directamente a oligonucleótidos de ssDNA formadores de G4. La afinidad de unión se correlacionó con la estabilidad del G4:
     • El HSI-G4 altamente estable (puntuación 89) mostró una unión fuerte, mientras que el HSII-G4 menos estable (puntuación 29) mostró una unión débil.
     • El aumento de la concentración de KCl (que estabiliza los G4) y la adición de PDS mejoraron significativamente la unión de PRDM9 a los G4 estables (motivo Q4), pero tuvieron un efecto mínimo en los G4 inestables (motivo Q1).
   • Reconocimiento de G4 artificiales: PRDM9 se unió a una secuencia G4 artificial (no presente en el genoma humano) que formaba una topología híbrida estable. La mutación de esta secuencia para evitar la formación de G4 abolió la unión, confirmando que PRDM9 reconoce la estructura secundaria en sí misma, independientemente del contexto de la secuencia primaria específica.

3. Unión competitiva:

   • En los ensayos de competencia EMSA, los oligonucleótidos G4 estables compitieron eficazmente con los fragmentos de puntos calientes de dsDNA canónicos por la unión a PRDM9. Los G4 menos estables mostraron una capacidad competitiva reducida, reforzando el vínculo entre la estabilidad estructural y el reconocimiento.

Significancia y afirmaciones
Los autores proponen un modelo donde las estructuras estables de G-cuádruplex actúan como un nuevo motivo de reconocimiento para PRDM9, funcionando junto con el reconocimiento de secuencia específico de dedos de zinc canónico. El artículo afirma que:

• Reconocimiento estructural: PRDM9 puede reconocer y unirse directamente a las estructuras secundarias G4, no solo a la secuencia de ADN primaria.
• Dependencia de la estabilidad: La eficiencia de este reconocimiento depende estrictamente de la estabilidad termodinámica de la estructura G4; los G4 altamente estables son preferencialmente unidos.
• Especificación de puntos calientes: Los G4 estables probablemente facilitan el reclutamiento de PRDM9 al crear o mantener entornos de cromatina discretos y accesibles. Esto proporciona un mecanismo para que PRDM9 se dirija a loci específicos incluso cuando el motivo de secuencia primaria es subóptimo o cuando el sitio carece de un motivo consenso.
• Implicaciones evolutivas: El estudio sugiere que las variaciones en la estabilidad de los G4 (por ejemplo, debido a SNPs como rs74149540) podrían modular la afinidad de unión de PRDM9 y la actividad de los puntos calientes, contribuyendo a la rotación dinámica de los puntos calientes de recombinación y a los paisajes de recombinación específicos de la población.

El artículo concluye que la estructura secundaria del ADN constituye una capa adicional de información que regula la recombinación meiótica, ofreciendo un marco para reconciliar la ocupación de PRDM9 en sitios que carecen de motivos consenso y explicando el enriquecimiento de la unión de PRDM9 en las regiones asociadas a promotores. Los autores reconocen las limitaciones, señalando que el estudio se basa en ensayos in vitro y predicciones computacionales, y que se requiere trabajo futuro para establecer el papel causal del reconocimiento de G4 en la formación de DSB in vivo.