Conservation and divergence in the allosteric architectures of five human protein kinases

기술 요약: 5가지 인간 단백질 키나아제의 올로스테릭 구조에서의 보존성과 분화

문제 제述
단백질 키나아제는 생물학적 조절의 중심이며, 임상적으로 승인된 약물이 거의 100개에 달할 정도로 치료적 개입의 빈번한 표적이 된다. 그러나 ATP 결합 활성 부위의 높은 구조적 보존성으로 인해 특정 키나아제 억제제 개발이 어려우며, 이는 표적 이탈 독성(off-target toxicity)과 저항성 돌연변이를 초래한다. 기능적인 이차 부위(올로스테릭 부위)를 표적으로 하는 것은 특이성을 높이고 키나아제를 활성화할 수 있는 경로를 제공하지만, 대다수 키나아제의 기능적 이차 부위는 여전히 알려지지 않았다. 또한, 동일한 구조적 접힘(fold)을 공유하는 키나아제들의 에너지 및 올로스테릭 구조가 고도로 보존되어 있는지, 아니면 유의미하게 분화되어 단백질 특이적인 조절 네트워크를 형성하는지는 불분명하다.

방법론
저자들은 다섯 가지 인간 단백질 키나아제인 SRC, FGR, JNK2 (MAPK9), ZAK (MAP3K20), TSSK2에 대한 완전한 에너지 및 올로스테릭 지도를 생성하기 위해 KINASE-MAPS(Kinase-Mutational Allosteric Propagation Scan)라고 명명된 고처리량 실험 플랫폼을 사용하였다. 이 키나아제들은 다양한 생리학적 역할, 질병 연관성 및 진화적 거리를 나타내도록 선택되었다(두 개의 SRC 가계 티로신 키나아제와 서로 다른 그룹에 속하는 세 개의 세린/트레오닌 키나아제).

방법론은 네 가지 주요 단계로 구성된다:

1. 라이브러리 구축: 저자들은 SUNi 돌연변이 유발법을 사용하여 각 단백질의 전체 키나아제 도메인(269–357 잔기)을 덮는 조합적 이중 돌연변이 라이브러리를 구축하였다. 이 라이브러리들은 모델 피팅을 제한하기 위해 8개의 서로 다른 유전적 배경 내에서 가능한 모든 단일 아미노산 치환을 인코딩한다.
2. 활성 정량화: Saccharomyces cerevisiae에서의 세포 기반 독성 분석을 사용하여 키나아제 활성을 정량화하였다. 독성은 활성 의존적임이 검증되었으며, 세 번의 독립적인 반복 실험을 통해 선택이 수행되었다.
3. 풍부도 정량화: 샌드위치 단백질-단편 상보 분석(sPCA)을 이용한 성장 기반 선택법을 사용하여 모든 라이브러리 변이체의 접힌 단백질 풍부도(abundance)를 정량화함으로써, 촉매 작용에 미치는 영향과 단백질 안정성에 미치는 영향을 구분하였다.
4. 열역학 모델링: 현상학적 에너지 모델(MoCHI)을 결합된 활성 및 풍부도 데이터에 적합시켰다. 이 모델은 세 가지 단백질 상태(펼쳐진 상태, 접힌-비활성 상태, 접힌-활성 상태)를 가정하며, 이중 돌연변이에서의 가산성을 가정하여 각 단일 아미노산 변이체에 대한 접힘 자유 에너지($\Delta\Delta G_f$)와 활성 자유 에너지($\Delta\Delta G_a$)를 추론한다.

주요 기여 및 결과
본 연구는 160,000개 이상의 변이체의 효과를 정량화하여 다섯 가지 키나아제에 대해 약 50,000개의 자유 에너지 변화 데이터셋을 생성하였다. 주요 결과는 다음과 같다:

• 접힘 안정성의 보존 vs. 올로스테릭 구조의 분화: 불안정화 돌연변이는 모든 다섯 가지 키나아제에서 단백질 코어(core)에 걸쳐 일반적으로 농축되지만, 안정성에 결정적인 특정 구조적 영역은 서로 다르다. 예를 들어, 불안정화 돌연변이는 SRC, FGR, ZAK에서는 C-lobe에 농축되는 반면, JNK2에서는 N-lobe에 농축된다.
• 거리 의존적이지만 비등방성인 억제: 억제성 올로스테릭 돌연변이는 다섯 가지 키나아제 모두에서 활성 부위로부터 보존된 거리 의존적 감쇄를 보이지만, 중간 반경 거리($d_{1/2}$)는 9.3 Å이다. 그러나 이러한 올로스테릭 효과는 매우 비등방적(anisotropic)이다. 결합력은 $\alpha$C-helix를 향해서는 가장 강하고 $\alpha$D-helix를 향해서는 가장 약하다. 이 결합의 강도는 특정 방향에 따라 키나아제 간에 크게 달라진다(예: JNK2는 활성화 루프를 향해 강한 결합을 보이는 반면, ZAK는 그렇지 않다).
• 활성화 부위의 분화: 억제성 돌연변이와 달리, 활성화 돌연변이는 활성 부위 근처에 농축되지 않는다. 대신, 이들은 구조적으로 분산되어 있으며 키나아제 특이적이다. 키나아제 간에 공유되는 활성화 부위는 극히 일부에 불과하며, 이 부위들의 구조적 분포는 현저하게 다르다(예: SRC/JNK2/ZAK에서는 C-lobe에 농축되지만, TSSK2에서는 N-lobe에 농축됨).
• 보존된 및 키나아제 특이적 올로스테릭 포켓: 저자들은 FTMap을 사용하여 다섯 가지 키나아제 전반에 걸쳐 37개의 뚜렷한 단편 크기 포켓(fragment-sized pockets)을 식별하였다.
  • 보존된 억제 포켓: 다섯 가지 키나아제 모두에서 억제 돌연변이가 농축된 다섯 개의 포켓(DFG, MT3 및 두 개의 미분류된 인터로브 포켓 포함)은 기능적으로 보존된 억제 표면을 시사한다.
  • 키나아제 특이적 포켓: 각 키나아제는 고유한 추가 억제 및 활성화 포켓을 보유하고 있다. 예를 들어, JNK2는 기질 모집 표면(DRS 및 DEF)에 해당하는 특정 포켓을 가지며, SRC는 $\alpha$C helix 근처에 고유한 포켓을 가진다.
  • 스위칭 포켓: 몇몇 포켓은 한 키나아제에서는 활성화적이지만 다른 키나아제에서는 억제적인 "스위칭" 동작을 보인다(예: PIF 포켓은 JNK2에서는 활성화적이지만 TSSK2에서는 억제적이다).
• 표면 분화: 가장 밀접하게 관련된 두 키나아제(SRC와 FGR)는 유사한 표면 돌연변이 효과를 공유하지만, 더 멀리 떨어진 키나아제들은 올로스테릭 표면에서 상당한 분화를 보인다.

의의
본 논문은 이 결과들이 동족 단백질 내의 에너지 및 올로스테릭 구조에 대한 최초의 종합적인 비교 분석을 제공한다고 주장한다. 저자들은 키나아제들이 보존된 촉매 코어와 특정 올로스테릭 감쇄 원칙(거리 의존적, 비등방성)을 공유하지만, 그들의 올로스테릭 구조는 각 단백질에 고유하다고 결론짓는다.

이 연구의 의의는 다음을 입증하는 데 있다:

1. 단백질 특이성이 규칙이다: 동일한 3D 접힘을 공유함에도 불구하고, 각 키나아제는 조절 및 치료적 표적화를 위한 별도의 기능적 이차 부위를 가진다.
2. 치료적 함의: 보존된 억제 포켓의 식별은 광범한 스펙트럼의 조절을 위한 잠재적 표적을 제공하며, 키나아제 특이적 포켓(억제 및 활성화 모두)의 발견은 ATP 경쟁적 억제제와 관련된 선택성 및 저항성 문제를 극복하기 위한 고도로 특이적인 약물 개발의 합리적 근거를 제공한다.
3. 진화적 통찰: 이 데이터는 보존된 촉매 코어가 분화된 조절 제어 위에 겹쳐져 있다는 일반적인 단백질 진화 원리를 시사하며, 생물학적 조절을 완전히 이해하고 고급 치료제를 설계하기 위해서는 단백질 특이적인 실험적 지도가 필요함을 보여준다.