Structural divergence in protein evolution of a photoreceptor family undetected by AlphaFold is observed by high sensitivity FT-IR spectroscopy

기술 요약: 단백질 진화에서의 구조적 분기, AlphaFold가 감지하지 못한 결과

문제 제기
단백질 가족 내의 기능적 및 구조적 분기는 분자 진화의 근본적인 메커니즘입니다. AlphaFold는 원자 해상도의 단백질 구조 예측에 혁신을 가져왔으나, 기능적 분사와 관련된 미세한 구조적 변화를 포착할 수 있는지에 대해서는 아직 검증되지 않았습니다. Photoactive Yellow Protein (PYP) 가족, 특히 Halorhodospira halophila 유래의 두 상동 단백질인 PYP1과 PYP2는 독특한 사례 연구를 제공합니다. 이들은 60%의 서열 동일성을 공유함에도 불구하고, pB 신호 전달 중간체의 수명($\tau_{pB}$)에서 100배의 차이를 보이며 서로 다른 피크 흡수 파장($\lambda_{max}$)을 나타냅니다. 이전 연구들은 스펙트럼 조율($\lambda_{max}$)에 영향을 미치는 잔기들을 식별했지만, 극적인 운동학적 분기($\tau_{pB}$)를 유도하는 구조적 메커니즘은 여전히 제대로 이해되지 않고 있습니다. 나아가, AlphaFold가 이러한 기능적 차이를 만들어내는 구조적 재배열을 감지할 수 있는지 여부도 알려지지 않았습니다.

방법론
저자들은 계통적 서열 재구성(ASR), 계산 모델링, 그리고 고감도 분광법을 결endo한 다각적인 접근 방식을 채택했습니다:

1. 계통적 서서열 재구성 (ASR): 984개의 현존하는 PYP 상동 단백질을 포함하는 정교한 다중 서열 정렬을 사용하여, 저자들은 PYP1과 PYP2의 최공통조상(LCA) 및 세 개의 중간 조상 노드(Node 1A, Node 1B, Node 2A)를 재구성했습니다.
2. 단백질 부활 및 특성 분석: LCA와 중간 조상들의 유전자를 합성하고, E. coli에서 발현 및 정제했습니다. 재구성된 단백질들의 기능적 특성은 UV/Vis 흡수 분광법을 통해 $\lambda_{max}$와 pB 중간체의 수명($\tau_{pB}$)을 결정함으로써 규명되었습니다.
3. 구조 예측 계산: AlphaFold2를 사용하여 재구성된 조상 단백질들과 PYP2의 3D 구조를 예측했습니다. 이 예측 구조들은 PYP1(PDB: 1NWZ)의 고해상도 결정 구조와 RMSD(Root Mean Square Deviation) 계산을 통해 비교되었습니다.
4. FTIR 분광법: 구조 예측을 실험적으로 검증하기 위해, 저자들은 고감도 2차 미분 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광법을 최적화했습니다. 이 기술은 다음을 조사하는 데 사용되었습니다:
   • 활성 부위 수소 결합: $\lambda_{max}$와 상관관계가 있는 Glu46의 C=O 신축 모드.
   • 이차 구조: $\alpha$-헬릭스 및 $\beta$-시트 함량의 변화를 감지하기 위한 Amide I 영역 분석.

주요 결과

• 기능적 분기: 재구성된 LCA는 446 nm의 $\lambda_{max}$와 0.08초의 $\tau_{pB}$를 나타냈으며, 이는 PYP1(447 nm, 0.5 s)과 표현형적으로 유사했습니다. PYP2로의 진화 경로는 442 nm로의 $\lambda_{max}$ 이동과 약 52초에 달하는 극적인 $\tau_{pB}$ 증가를 수반했습니다. 중간 단계인 Node 2A는 이미 PYP2와 유사한 운동학적 특성($\tau_{pB}$ = 46 s)을 보여주었으며, 이는 운동학적 분기가 PYP2로 이어지는 계통에서 초기에 발생했음을 시사합니다.
• AlphaFold 예측: AlphaFold2는 모든 조상 노드와 PYP2에 대해 높은 신뢰도로 구조를 예측했습니다. 예측된 구조들과 PYP1 결정 구조 사이의 쌍별 RMSD 계산 결과는 0.1에서 1.1 Å 사이였으며, 0.55 Å 근처에 집중되었습니다. 이 값들은 PYP1의 서로 다른 결정 형태들 사이에서 나타나는 변이 범위 내에 있으며, 이는 AlphaFold가 PYP2와 그 조상들을 PYP1과 구조적으로 구별 불가능하게 예측한다는 결론으로 이어집니다.
• FTIR 분광법 결과:
  • 활성 부위: FTIR 스펙트럼은 Glu46 수소 결합 강도와 $\lambda_{max}$ 사이의 관계를 확인해주었습니다. PYP1, Node 1A, Node 1B(447 nm)는 1726 cm$^{-1}$에서 Glu46 C=O 신축 모드를 보였습니다. 반면 PYP2와 Node 2A(442 nm)는 1723 cm$^{-1}$로 이동하여 더 강한 수소 결합을 나타냈습니다. 흥미롭게도, LCA(446 nm) 역시 1723 cm$^{-1}$의 이동을 보였는데, 이는 단순한 서열 분석으로는 포착할 수 없는 보상적 구조 조정을 시사합니다.
  • 이차 구조: 가장 중요한 발견은 Amide I 영역에서 나타났습니다. PYP1, Node 1A, Node 1B는 $\alpha$-헬릭스(1644 cm$^{-1}$)와 $\beta$-시트(1634 cm$^{-1}$, 1688 cm$^{-1}$)를 특징짓는 피크를 보였으나, Node 2A와 PYP2는 1644 cm$^{-1}$에서의 $\alpha$-헬릭스 피크가 거의 완전히 소실되었습니다. 저자들은 2차 미분 스펙트럼에서 나타나는 진폭 감소를 구조적 불균질성 증가와 이차 구조의 상당한 조정 때문이라고 설명했습니다.

주요 기여 및 의의
본 연구의 주요 기여는 단백질 가족 내에서 상당한 구조적 분기가 AlphaFold2와 같은 최첨단 구조 예측 도구에 의해 감지되지 않은 채 발생할 수 있음을 입증한 것입니다.

1. AlphaFold의 한계: 본 연구는 결정적인 한계를 드러냅니다. AlphaFold2는 PYP2와 그 조상들의 전역적 폴드(global fold)가 PYP1과 동일하다고 높은 신뢰도로 예측했으나, 실험적 증거(FTIR)는 뚜렷한 이차 구조 변화와 100배의 기능적 운동학 차이가 존재함을 보여주었습니다.
2. ASR 및 분광법의 유효성 검증: 이 논문은 계통적 서열 재구성과 고감도 FTIR 분광법을 결합하여 진화적 메커니즘을 밝혀내는 유용성을 입증했습니다. 이 접근 방식은 진화적 궤적을 성공적으로 재현하여, PYP2의 느린 운동학 및 청색 편이된 스펙트럼으로의 전환이 상당한 이차 구조의 재배열을 수반했음을 식별해냈습니다.
3. 기전적 통찰: 결과는 PYP1과 PYP2 사이의 기능적 분기가 현재 세대의 구조 예측 알고리즘이 포착하지 못하는 이차 구조 함량 및 활성 부위 수소 결합을 변화시키는 구조적 조정에 의해 구동됨을 시사합니다.

결론
저자들은 AlphaFold가 강력한 도구이긴 하지만, 단백질 진화를 주도하는 미세하고 기능적으로 중요한 구조적 조정을 포착하는 데 실패할 수 있다고 결론지었습니다. 이 연구는 단백질 가족의 기능적 분위의 구조적 기초를 완전히 이해하기 위해, 특히 이차 구조 변화를 감지할 수 있는 분광법을 사용하는 실험적 검증이 필수적임을 강조합니다.