Genetic diversity, phylogeny, and population structure of Leishmania isolates from cutaneous leishmaniasis patients in Ethiopia

기술 요약: 에티오피아 피부 리슈만편모충증 환자 유래 리슈마니아 분리주의 유전적 다양성, 계통 발생 및 집단 구조

문제 제기
피부 리슈만편모충증(CL)은 에티오피아에서 연간 약 20,000~30,000건의 신규 사례가 발생하는 중요한 공중보건 부담입니다. 역사적으로 에티오피아의 이 질환은 거의 독점적으로 Leishmania aethiopica에 의한 것으로 간주되어 왔습니다. 그러나 최근의 분자 생물학적 증거는 Leishmania donovani, L. tropica 및 잠재적 하이브리드(잡종)를 포함한 더 복잡한 병인론을 시사합니다. 이러한 종 다양성은 임상 관리를 복잡하게 만듭니다. 왜냐하면 서로 다른 종과 하이브리드는 다양한 병원성, 조직 친화성, 그리고 에티오피아 CL 환자들에게서 만족스럽지 못한 완치율을 보인 표준 치료제인 스타이보글루코네이트 나트륨(SSG)에 대한 반응이 다를 수 있기 때문입니다. 이러한 징후에도 불구하고, 에티오피아에서 CL을 일으키는 리슈마니아 종의 유전적 다양성, 계통 발생 및 집단 구조는 여전히 충분히 규명되지 않았으며, 이는 분자 감시 및 임상 전략을 맞춤화하는 데 한계로 작용하고 있습니다.

연구 방법
본 연구는 LeishAccess 임상 시험 내에서 수행된 교차적, 실험실 기반 유전 분석을 채택하였습니다.

• 시료 수집: 에티오피아의 네 가지 다양한 임상 현장인 Boru Meda 종합병원(BMGH), ALERT 종합병원, Arba Minch 종합병원(AMGH), Wacha 보건 센터(WHC)에서 파라사이트 확진을 받은 96명의 CL 환자로부터 피부 슬릿 도말(SSS) 시료를 수집하였습니다.
• 염기서열 분석: rDNA의 내부 전사 간격 1(ITS1) 영역을 증폭하고 염기서열을 분석하였습니다. 본 연구는 96개의 임상 분리주, GenBank에서 검색된 48개의 서열, 9개의 참조 균주로 구성된 167개의 ITS1 데이터셋을 활용하였습니다.
• 생물정보학 및 분석:
  • 계통 발생: IQ-TREE를 사용하여 GTR+F+G4 치환 모델을 적용한 최대 우도(Maximum Likches) 계통수를 구축하였습니다. 가지 지지도는 울트라패스트 부트스트랩(UFBoot)을 통해 평가되었습니다.
  • 종 식별: 단계통 클러스터링과 BLASTn 일치도(≥98.5%)를 바탕으로 분리주를 종 복합체에 할당하였습니다.
  • 모티프 분석: ITS1 영역 내의 다형성 마이크로새텔라이트 유사 모티프(poly-C, poly-A, poly-TA)를 분석하여 L. donovani 복합체 내의 유전자형을 구분하였습니다.
  • 집단 유전학: L. aethiopica 분리주에 대해 뉴클레오타이드 다양성($\pi$), 하플로타입 다양성($H_d$), Tajima's D를 계산하였습니다. 쌍별 유전적 차이($F_{ST}$)를 추정하였고, 주성분 분석(PCA), 계층적 클러스터링, TCS 하플로타입 네트워크를 사용하여 집단 구조를 시각화하였습니다.
  • 임상 상관관계: 파라사이트 하플로타입과 치료 결과(완치 대 실패) 사이의 연관성을 카이제곱 검정, PERMANOVA, AMOVA를 사용하여 평가하였습니다.

주요 결과

• 종 복잡성: 성공적으로 유형이 분류된 96개 분리주 중 88.5%(85/96)는 L. aethiopica로 클러스터링되었고, 11.5%(11/96)는 L. donovani 종 복합체 또는 L. tropica에 속했습니다. 이러한 비-aethiopica 종들은 불균등한 지리적 분포를 보였으며, Boru Meda(45.5%)와 Wacha(36.4%)에서 가장 높은 비율이 나타났습니다.
• L. aethiopica의 유전적 다양성:
  • 다양성 지표: L. aethiopica는 매우 높은 하플로타입 다양성($H_d = 0.9929$)을 나타냈습니다. 뉴클레오타이드 다양성($\pi$)은 맥락에 따라 달랐습니다. 전체 계통 데이터셋(글로벌 참조 균주 포함)은 높은 다양성($\pi = 0.0502$)을 보였으나, 48개의 고품질 에티오피아 ITS1 서열만을 대상으로 한 분석에서는 $\pi = 0.0144$의 뉴클레오타이드 다양성을 나타냈습니다.
  • 인구 통계적 역사: 모든 지역에서 나타난 유의미한 음(-)의 Tajima's D 값($D = -2.66, p < 0.01$)은 에티오피아 내 L. aethiopica 집단의 최근 급격한 인구 통계적 확장을 시사합니다.
  • 집단 구조: 네 곳의 지리적 지역 간 유전적 차이는 미미하였으며($F_{ST} \approx 0.031$), 이는 상당한 유전자 흐름 또는 공유된 진화 역사를 나타냅니다. PCA 및 클러스터링 분석은 제한적인 계통 지리학적 구조를 보여주었으며, 서로 다른 지역의 분리주들은 대체로 혼합되어 나타났습니다.
• SNP 경관: ITS1 영역 분석 결과 96개의 고신뢰 SNP가 발견되었습니다. 이 중 11개는 모든 샘플링 지역에서 완전히 고정(빈도 = 1.0)되었으며, 5개는 거의 고정(빈도 $\ge$ 0.97)되었습니다. 이러한 불변의 특징적 서열은 종 특이적 분자 진단을 위한 잠재적 표적으로 제안됩니다.
• L. donovani 복합체의 유전자형 변이: ITS1 모티프 분석 결과 L. donovani 복합체 내의 이질성이 드러났습니다. 일부 분리주는 L. infantum과 클러스터링되는 "Type A" 서열을 보였으나, 다른 것들은 L. donovani Type E 및 F와 일치했습니다. 특히, 한 분리주(AB004)는 계통학적으로는 L. infantum에 위치하면서도 ITS1 모티프는 L. donovani Type E와 일치하여, 잠재적인 재조합 또는 하이브리드 형성 사건을 시사했습니다.
• 치료 결과: 파라사이트 하플로타입(또는 특정 SNP)과 치료 결과(완치 대 실패) 사이의 통계적으로 유의미한 연관성은 발견되지 않았습니다. 유전적 변이는 결과 그룹 간보다는 결과 그룹 내에서 압도적으로 나타났습니다 ($\Phi_{ST} = 0.022, p = 0.805$).

의의 및 주장
본 연구는 에티오피아 CL이 오직 L. aethiopica에 의해서만 발생한다는 전통적인 패러다임에 도전하며, L. donovani 및 L. tropica가 공존하는 복잡한 다종 병인론을 확인하였습니다. 저자들은 L. aethiopica의 높은 하플로타입 다양성과 약한 지리적 구조가 지역적 격리보다는 인간의 이동성과 매개체 분산에 의해 주도된, 연결된 집단 내에서의 최근 인구 통계적 확장을 반영한다고 주장합니다.

L. aethiopica에서 발견된 고정 및 거의 고정된 SNP의 식별은 견고한 분자 진단 및 감시 도구 개발을 위한 중요한 기여로 강조됩니다. 또한, L. donovani 복합체 내의 잠재적 하이브리드 및 다양한 유전자형의 발견은 임상적 표현형과 약물 감수성에 영향을 미칠 수 있는 이 기생충들의 유전적 가소성을 강조합니다.

본 논문은 현재의 데이터가 특정 L. aethiopica 유전자형과 치료 실패 사이의 직접적인 연관성을 뒷받침하지는 않지만, 유전적 이질성과 다종적 특성이 강화된 분자 감시를 필요로 한다고 결론짓습니다. 저자들은 현재의 ITS1 마커에 대한 의존도가 더 깊은 집단 구조나 잠재적 재조합을 가릴 수 있음을 언급하며, 전장 게놈 시퀀싱 연구를 통해 전파 역학을 완전히 규명하고 임상 관리를 가이드할 것을 권고합니다.