Genetic diversity, phylogeny, and population structure of Leishmania isolates from cutaneous leishmaniasis patients in Ethiopia

Resumen Técnico: Diversidad Genética, Filogenia y Estructura Poblacional de Aislados de Leishmania de Pacientes con Leishmaniasis Cutánea en Etiopía

Planteamiento del Problema
La leishmaniasis cutánea (LC) representa una carga de salud pública significativa en Etiopía, con un estimado de 20,000 a 30,000 nuevos casos anuales. Históricamente, la enfermedad en Etiopía se atribuía casi exclusivamente a Leishmania aethiopica. Sin embargo, la evidencia molecular reciente sugiere una etiología más compleja, que incluye la presencia de Leishmania donovani, L. tropica y posibles híbridos. Esta diversidad de especies complica el manejo clínico, ya que diferentes especies e híbridos pueden exhibir diversas virulencias, tropismo tisular y respuestas a tratamientos estándar como el estibogluconato de sodio (SSG), el cual ha mostrado tasas de curación insatisfactorias en pacientes etíopes con LC. A pesar de estos indicios, la diversidad genética, la filogenia y la estructura poblacional de las especies de Leishmania que causan la LC en Etiopía permanecen insuficientemente caracterizadas, lo que limita la capacidad de adaptar la vigilancia molecular y las estrategias clínicas.

Metodología
Este estudio empleó un análisis genético de laboratorio de corte transversal integrado dentro del ensayo clínico LeishAccess.

• Recolección de Muestras: Se recolectaron muestras de raspado de piel (SSS) de 96 pacientes con LC parasitológicamente confirmada en cuatro sitios clínicos diversos en Etiopía: Hospital General Boru Meda (BMGH), Hospital Especializado Integral ALERT, Hospital General Arba Minch (AMGH) y Centro de Salud Wacha (WHC).
• Secuenciación: Se amplificó y secuenció la región del Espaciador Transcrito Interno 1 (ITS1) del ADN ribosómico. El estudio utilizó un conjunto de datos de 167 secuencias de ITS1, compuesto por 96 aislados clínicos, 48 secuencias recuperadas de GenBank y 9 cepas de referencia.
• Bioinformática y Análisis:
  • Filogenia: Se construyeron árboles filogenéticos de máxima verosimilitud utilizando IQ-TREE con el modelo de sustitución GTR+F+G4. El soporte de las ramas se evaluó mediante el método de ultrafast bootstrap (UFBoot).
  • Identificación de Especies: Los aislados se asignaron a complejos de especies mediante el agrupamiento monofilético con cepas de referencia e identidad de BLASTn (≥98.5%).
  • Análisis de Motivos: Se analizaron los motivos de tipo microsatélite polimórficos (poly-C, poly-A, poly-TA) dentro de la región ITS1 para diferenciar genotipos dentro del complejo L. donovani.
  • Genética de Poblaciones: Para los aislados de L. aethiopica, el estudio calculó la diversidad de nucleótidos ($\pi$), la diversidad de haplotipos ($H_d$) y el estadístico de Tajima's D. Se estimó la diferenciación genética entre pares ($F_{ST}$) y se visualizó la estructura poblacional mediante Análisis de Componentes Principales (PCA), agrupamiento jerárquico y redes de haplotipos TCS.
  • Correlación Clínica: Se evaluaron las asociaciones entre los haplotipos del parásito y los resultados del tratamiento (curación vs. fracaso) mediante pruebas de chi-cuadrado, PERMANOVA y AMOVA.

Resultos Clave

• Complejidad de Especies: De los 96 aislados tipificados con éxito, el 88.5% (85/96) se agrupó con L. aethiopica, mientras que el 11.5% (11/96) perteneció al complejo de especies de L. donovani o L. tropica. Estas especies no-aethiopica mostraron una distribución geográfica desigual, con las proporciones más altas encontradas en Boru Meda (45.5%) y Wacha (36.4%).
• Diversidad Genética de L. aethiopica:
  • Métricas de Diversidad: L. aethiopica exhibió una diversidad de haplotipos excepcionalmente alta ($H_d = 0.9929$). La diversidad de nucleótidos ($\pi$) varió según el contexto: el conjunto filogenético completo (incluyendo referencias globales) mostró una alta diversidad ($\pi = 0.0502$), mientras que el análisis de las 48 secuencias de ITS1 de alta calidad de Etiopía produjo una diversidad de nucleótidos de $\pi = 0.0144$.
  • Historia Demográfica: Los valores significativamente negativos de Tajima's D ($D = -2.66, p < 0.01$) en todos los sitios sugieren una expansión demográfica reciente y rápida de la población de L. aethiopica en Etiopía.
  • Estructura Poblacional: La diferenciación genética entre los cuatro sitios geográficos fue débil ($F_{ST} \approx 0.031$), lo que indica un flujo génico sustancial o una historia evolutiva compartida. Los análisis de PCA y de agrupamiento mostraron una estructuración filogeográfica limitada, con los aislados de diferentes sitios mayoritariamente mezclados.
• Panorama de SNPs: El análisis de la región ITS1 reveló 96 SNPs de alta confianza. Entre ellos, 11 estaban totalmente fijados (frecuencia = 1.0) y 5 estaban casi fijados (frecuencia $\ge$ 0.97) en todos los sitios de muestreo. Estas firmas invariantes se proponen como posibles objetivos para diagnósticos moleculares específicos de especie.
• Variación Genotípica en el Complejo L. donovani: El análisis de motivos de ITS1 reveló heterogeneidad dentro del complejo L. donovani. Algunos aislados mostraron firmas del "Tipo A" agrupándose con L. infantum, mientras que otros coincidieron con los tipos E y F de L. donovani. Notablemente, un aislado (AB004) mostró una ubicación filogenética con L. infantum, pero con motivos de ITS1 consistentes con el tipo E de L. donovani, lo que sugiere posibles eventos de recombinación o hibridación.
• Resultados del Tratamiento: No se encontró una asociación estadísticamente significativa entre los haplotipos del parásito (o SNPs específicos) y los resultados del tratamiento (curación vs. fracaso). La varianza genética se encontró abrumadoramente dentro de los grupos de resultados en lugar de entre ellos ($\Phi_{ST} = 0.022, p = 0.805$).

Significancia y Afirmaciones
El estudio desafía el paradigma tradicional de que la LC en Etiopía es causada exclusivamente por L. aethiopica, confirmando una etiología compleja y multiespecífica que involucra a L. donovani y L. tropica en una transmisión simpátrica. Los autores afirman que la alta diversidad de haplotipos y la débil estructura geográfica de L. aethiopica reflejan una expansión demográfica reciente dentro de una población conectada, impulsada probablemente por la movilidad humana y la dispersión de vectores, en lugar de un fuerte aislamiento regional.

La identificación de SNPs fijos y casi fijos en L. aethiopica se destaca como una contribución significativa para el desarrollo de herramientas robustas de diagnóstico molecular y vigilancia. Además, la detección de posibles híbridos y diversos genotipos dentro del complejo L. donovani subraya la plasticidad genética de estos parásitos, lo que puede influir en los fenotipos clínicos y la susceptibilidad a los fármacos.

El artículo concluye que, si bien los datos actuales no respaldan un vínculo directo entre genotipos específicos de L. aethiopica y el fracaso del tratamiento, la heterogeneidad genética y la naturaleza multiespecie de la enfermedad requieren una vigilancia molecular mejorada. Los autores recomiendan futuros estudios de secuenciación de todo el genoma para elucidar completamente la dinámica de transmisión y guiar el manejo clínico, señalando que la dependencia actual del marcador ITS1 podría enmascarar estructuras poblacionales más profundas o recombinaciones crípticas.