Phosphorylation of dynamin-related protein 1 at Ser616 promotes autophagy to suppress Mycobacterium tuberculosis survival via the ROS/HIF-1α axis in macrophages

기술 요약: Drp1의 Ser616 인산화는 대식세포 내 ROS/HIF-1α 축을 통해 자가포식을 촉진하여 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 생존을 억제한다

문제 제기
결핵균(Mtb)에 의해 발생하는 결핵(TB)은 여전히 전 세계적으로 높은 사망률을 기록하는 주요 질환이다. 대식세포는 선천 면역의 중심 역할을 하지만, 동시에 Mtb가 생존하고 증식하는 니치(niche) 역할도 한다. Mtb 병인론에 대한 이해에서 중요한 공백은 미토콘드리아 역동성, 특히 분열(fission)이 숙주의 선천적 방어 기제를 어떻게 조절하는지에 대한 구체적인 특성화가 미흡하다는 점이다. 미토콘드리아 융합 단백질인 Mfn2는 항-Mtb 면역과 연관된 것으로 알려져 있으나, 핵심 분열 단백질인 Dynamin-related protein 1 (Drp1)의 구체적인 역할과 분자적 기전은 세포 내 Mtb 생존을 제한하는 측면에서 여전히 불분데하다. 또한, Mtb 감염 맥락에서 특정 Drp1 인산화 부위의 기능적 관련성은 직접적으로 다뤄진 바 없다.

연구 방법
본 연구는 대식세포의 항-결핵 면역에서 Drp1의 역할을 규명하기 위해 in vitro 및 in vivo 접근 방식을 결합하여 사용하였다:

• 세포 모델: Mtb H37Rv에 감염된 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)와 RAW264.7 마우스 대식세포주를 사용하였다.
• 유전적 조작: Dnm1l (Drp1) 및 관련 분열 수용체(Fis1, Mff, MiD49, MiD51)를 노크다운하기 위해 siRNA와 shRNA를 활용하였다. 반대로, 야생형 Drp1(WT)과 인산화 결핍 돌연변이(S616A)를 과발현시키기 위해 렌티바이러스 벡터를 사용하였다. 마이엘로이드 특이적 Drp1 결손 마우스 모델(Dnm1l^Lyz2-cre)은 Dnm1l^fl/fl 마우스를 Lyz2-iCre 마우스와 교배하여 생성하였다.
• 약리학적 개입: 세포 및 마우스에 Mdivi-1 (Drp1 억제제), 3-MA (자가포식 억제제), NAC (ROS 제거제), L-NAME (NO 억제제), Roxadustat (HIF-1α 안정화제), CCCP (미토콘드리아 탈커플링제/자가포식 유도제) 등의 억제제 및 활성제를 처리하였다.
• 임상 샘양: 결핵 환자 및 대조군 대상의 p-Drp1 (Ser616) 수준을 평가하기 위해 폐 및 림프절 조직에 대해 면역조직화학 염색을 수행하였다.
• 분석법: 세균 부하 측정을 위한 CFU 분석, 단백질 발현(LC3, p62, HIF-1α, Parkin 등)을 위한 웨스턴 블롯팅, ROS 및 NO 검출을 위한 유세포 분석, 미토콘드리아 형태 및 공국소화(Mtb와 LC3, LAMP1, p62의 공국소화)를 위한 공초점 현미경 관찰, 그리고 mCherry-eGFP-LC3 리포터를 이용한 자가포식 흐름(autophagic flux) 분석을 수행하였다.

주요 결과

1. Drp1은 Mtb 생존을 제한한다: Mtb 감염은 미토콘드리아 파편화를 유도하고 대식세포 내 Drp1의 Ser616 부위 인산화를 상향 조절한다. Drp1을 유전적 또는 약리학적으로 억제하면 세포 내 Mtb 생존이 유의하게 증가한 반면, Drp1 과발현은 박테리아 부하를 제한하였다. In vivo에서 마이엘로이드 특이적 Drp1 결손 마우스는 대조군에 비해 폐 감염이 악화되고, 박테리아 부하가 증가하며, 염증이 심화되었다.
2. Xenophagy를 통한 기전: Drp1은 Mtb의 선택적 자가포식 제거(xenophagy)를 촉진한다. Drp1 침묵(silencing)은 LC3-II 지질 결합, Beclin-1 및 Atg5 발현, 그리고 Mtb와 LC3, p62, LAMP1의 공국소화를 감소시켰다. 반대로 Drp1 과발현은 이러한 마커들을 강화하였다. 이 효과는 AMPK/mTOR 및 Parkin 경로와 무관하였다. 왜냐하면 이러한 경로들을 조작해도 Drp1 결손으로 인한 결함을 회복시키지 못했기 때문이다.
3. ROS/HIF-1α 축: 본 연구는 구체적인 신호 전달 폭포를 확인하였다: Drp1은 ROS 생성을 촉진하고, 이는 HIF-1α를 안정화하여 자가포식을 유도한다.
   • Drp1 침묵은 ROS와 HIF-1α 수준을 감소시켰고, 과발현은 이를 증가시켰다.
   • ROS를 제거(NAC 사용)하면 Drp1 매개 자가포식과 박테리아 제어가 소멸되었다.
   • HIF-1α를 안정화(Roxadustat 사용)하면 Drp1이 결손된 세포에서도 자가포식과 박테리아 사멸이 회복되었다.
   • 이 경로는 일산화질소(NO) 생성과는 독립적이었다.
4. Ser616 인산화의 결정적 역할: 인산화 결핍 돌연변이인 S616A는 정상적인 총 단백질 수준과 뚜렷한 미토콘드리아 기능 이상이 없음에도 불구하고, ROS 생성, HIF-1α 안정화, 자가포식 흐름 또는 Mtb 제거를 촉진하지 못했다. 이는 Ser616 인산화가 결정적인 분자 스위치임을 입증한다.
5. 임상적 관련성: 결핵 환자 조직에 대한 면역조직화학 분석 결과, 대조 조직에 비해 p-Drp1 (Ser616) 수준이 유의하게 높음을 확인하였으며, 이는 해당 기전을 인간의 병리 현상과 연결시킨다.

주요 기여

• 새로운 면역 이펙터: 본 연구는 기존에 알려진 세포 사멸(apoptosis)이나 바이러스 면역에서의 역할과는 구별되는, Mtb에 대한 새로운 선천 면역 이펙터로서 Drp1을 확립하였다.
• 신호 축 정의: Drp1이 정형적인 AMPK/mTOR 또는 Parkin 매개 미토파지(mitophagy) 경로와는 독립적으로 작동하며, ROS/HIF-1α 의존적 경로를 통해 자가포식을 유도한다는 구체적인 신호 전달 체계를 규명하였다.
• 분자 스위치 식별: 본 연구는 일반적인 미토콘드리아 분열이나 기능 이상과 구별되는, Drp1의 항-마이코박테리아 기능을 위해 필수적인 조절 노드로서 Ser616 인산화를 지목하였다.
• 치료적 타겟팅: Drp1 활성화가 숙주 유래 기전을 통해 Mtb 생존을 제한함을 입증함으로써, 본 논문은 Drp1 S616 인산화를 표적으로 하는 잠재적인 치료 전략에 대한 기계적 근거를 제공한다.

의의
본 논문은 인산화된 Drp1(Ser616)이 대식세포의 항-결핵 면역에서 핵심적인 상위 조절 노드로 작용한다고 결론짓는다. ROS/HIF-1α 신호 전달 폭포를 트리거함으로써, Drp1은 세포 내 Mtb의 자가포식 제거를 용이하게 한다. 이러한 발견은 미토콘드리아 분열이 단순히 손상의 징후라는 통념에 도전하며, 이를 능동적인 숙주 방어 기제로 재정립한다. Ser616을 결정적인 스위치로 식별한 것은 Mtb 제거 능력을 향상시키기 위한 숙주 지향적 치료제 개발을 위한 구체적인 분자 표적을 제시한다. 본 연구는 이 특정 인산화 이벤트를 조절하는 것이 결핵과 싸우는 대식세포의 선천적 면역 능력을 복구하거나 강화할 수 있음을 강조한다.