Adrenomedullary Organoids Derived from Neural Crest and Schwann Cell Precursors

기술 요약: 신경능선 및 슈반 세포 전구체 유래 부신수질 오가노이드

문제 제기
부신수질은 스트레스 반응에 필수적이며, 크롬친화세포(chromaffin cells, ChrCs)를 통해 카테콜아민(에피네프린 및 노르에피네프린)을 분비한다. 최근의 발생 생물학 연구는 크롬친화세포의 기원에 대한 이해를 재정립하여, 두 가지 뚜렷한 신경능선 유래 전구체를 식별하였다: 초기 교감신경 부신 전구체(early sympathoadrenal progenitors, SAPs)는 부신수질의 약 2025%를 기여하고, 후기 슈반 세포 전구체(Schwann cell precursors, SCPs)는 나머지 7580%를 기여한다. 이러한 지식에도 불구하고, 특정 전구체 소스로부터 순수하고 기능적인 인간 크롬친화세포를 생성할 수 있는 유도 분화 프로토콜은 부족한 실정이다. 기존의 인간 다능성 줄기세포(hPSC) 분화 방법들은 혼합된 세포군을 생성하거나, SCP의 기여도를 다루지 못하거나, 불완전한 기능적 프로파일(예: 에피네프린 합성 능력 결여)을 가진 세포를 생성했다. 또한, SAP 유래와 SCP 유래 크롬친화세포 간의 기능적 차이, 특히 스트레스 상황에서의 카테콜아민 방출 프로파일에 대한 연구는 인간 시스템에서 아직 밝혀지지 않았다.

방법론
저자들은 인간 다능성 줄기세포(hPSC)를 사용하여 두 가지 별도의 경로를 통해 부신수질 오가노이드를 생성하는 유도 분화 프로토콜을 확립하였다:

1. SAP 경로: hPSC를 신경능선 세포로 분화시킨 후, 레티노산(RA)을 통해 후방화를 유도하여 몸통 정체성(trunk identity)을 확립하고, BMP4, SDF1, NRG1을 처리하여 SAP를 생성한다(Day 10). 이 SAP들을 구형체(spheroids)로 확장한 후, 특정 배지 칵테일(BMP4, 아스코르브산, NRG1, IGF2, NGF, FGF2, 덱사메타손, PMA 포함)을 사용하여 크롬친화세포로 분화시킨다.
2. SCP 경로: hPSC를 신경능선 세포로 분화시킨 후, FGF2, WNT, NRG1을 사용하여 16일 동안 SCP 형성에 유리한 상태로 유지한다. 그 후, 이 SCP들을 SAP 경로에서 사용한 것과 동일한 크롬친화세포 분화 및 성숙 배지에 노출시킨다.
3. 혼합 배양: 생리적인 부신수절의 구성을 모사하기 위해 SAP와 SCP 전구체를 20:80 비율로 혼합한다.
4. 특성 분석: 생성된 오가노이드는 면역형광 염색, RT-qPCR, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 마커 발현 및 카테콜아민 방출을 평가함으로써 특성화되었다. 기능적 분석에는 칼슘 이미징, H295R 부신피질 세포에 대한 코르티솔 자극 ELISA, 그리고 이동 및 통합을 평가하기 위한 병아리 배아로의 in vivo 이식이 포함되었다.
5. 단일 세포 전사체 분석: Day 30의 SAP, SCP, 혼합 배양 유래 오가노이드에 대해 scRNA-seq를 수행하여 발생 궤적을 매핑하고 세포 하위 유형을 식별하였다. 이 데이터는 재분석된 인간 태아 부신 데이터(임신 주수 9주)와 상관관계를 분석하였다.

주요 결과

• 기능적 오가노이드 생성: 두 가지 방식(SAP 유래 및 SCP 유래) 모두 성숙한 크롬친화세포 마커(TH, DBH, PNMT, Chromogranin A/B)를 발현하고 아세틸콜린(ACh) 및 PACAP 자극에 반응하여 노르에피네프린(NE)과 에피네프린(EPI)을 방출할 수 있는 3D 부신수질 오가노이드를 성공적으로 생성하였다.
• In Vivo 통합: 병아리 배아에 이식했을 때, SAP 전구체는 중신(mesonephros)/부신수질 영역으로 특이적으로 이동하였다. 성숙한 SAP 유래 오가노이드(Day 30)는 닭의 부신 조직에 통합되었으며, 인간 세포가 EPI를 공동 발현함으로써 in vivo 통합 능력을 확인하였다.
• 발생 가소성:
  • SAPs: 크롬친화세포로 효율적으로 분화되었으나 가소성은 제한적이었으며, 교감신경 뉴런과 슈반 세포를 매우 낮은 효율(~10% 및 ~5%)로 생성하였다.
  • SCPs: 크롬친화세포, 슈반 세포, 그리고 부교감 신경 뉴런으로 효율적으로 분화되었다(이전 연구에서 입증됨). 그러나 SCP는 교감신경 뉴런을 효율적으로 생성하지 못했다. 이들은 ~7%의 말초 뉴런(PRPH+)만을 생성하였고, 그중에서도 ~7%만이 교감신경 특성(TH+)을 보였는데, 이는 생성된 대부분의 뉴런이 비교감신경계(예: 장신경계 또는 부교감신경계)임을 시사한다.
• 전사체 하위 유형: scRNA-seq는 네 가지 뚜렷한 크롬친화세포 클러스터를 밝혔다.
  • SCP 유래: 주로 ChrC2 및 ChrC3 클러스터(97–99%)를 형성하였으며, 이들은 전형적인 마커를 발현하지만 PNMT는 결여되어 있었다(따라서 이 특정 클러스터 맥락에서는 EPI 생성 능력이 없음).
  • SAP 유래: 주로 새로운 ChrC1 클러스터(84.5% SAP 기원)를 형성하였으며, 이 클러스터는 높은 PNMT 발현과 AGTR1 및 CLDN11의 존재를 특징으로 하지만 TH 및 DBH와 같은 전형적인 마커는 결여되어 있다. 이 클러스터는 인간 태아 데이터에서 확인된 새로운 크롬친화세포 유사 집단과 상관관계가 있다.
• 스트레스 하에서의 기능적 분화: 기저 NE/EPI 방출은 유사했으나, 스트레스 자극 시 뚜렷한 프로파일을 보였다. SAP 유래 크롬친화세포는 더 높은 수준의 PNMT를 발현하며 스트레스 상황에서 더 많은 EPI를 방출하였다. 반면, SCP 유래 크롬친화세포는 더 높은 수준의 DBH를 발현하며 스트레스 상황에서 주로 NE를 방출하였고, EPI 방출은 낮은 PNMT 발현으로 인해 제한되었다.

주요 기여

1. 프로토콜 개발: 본 연구는 두 가지 경로(SAP 및 SCP)를 통해 hPSC로부터 기능적인 인간 부신수질 오가노이드를 생성하는 최초의 유도 분화 프로토콜을 제공한다.
2. 발생 검증: 본 연구는 인간 in vitro 시스템에서 부신의 이중 기원에 관한 최근의 in vivo 발견을 검증하여, SCP가 크롬친화세포의 주요 원천인 동시에 SAP가 더 작고 구별되는 하위 집단에 기여함을 확인하였다.
3. 새로운 하위 유형 발견: 전형적인 크롬친화세포와 전사체적으로 다르며 특정 태아 집단과 상관관계가 있는 새로운 SAP 유래 크롬친화세포 하위 유형(ChrC1/CLDN11+/AGTR1+)을 식별하였다.
4. 기능적 전문화: 발생 기원이 기능적 출력을 결정한다는 것을 입증하였다. 즉, SAP 유래 세포는 EPI 방출(심각한 스트레스 반응)에 특화되어 있고, SCP 유래 세포는 NE 방출(일상적 스트레스 반응)에 특화되어 있다.

의의
저자들은 이 부신수질 오가노이드가 크롬친화세포의 발달, 세포 간 상호작용, 그리고 신경아세포종(neuroblastoma) 및 갈색세포종(pheochromocytoma)과 같은 부신 질환을 연구하기 위한 가치 있는 인간 관련 모델을 제공한다고 주장한다. 부신의 뚜렷한 발생적 기원과 기능적 전문화를 재현함으로써, 이 오가노이드는 부신 발달을 구동하는 분자적 메커니즘을 조사하고 부신 질환에 대한 새로운 치료법을 스크리닝할 수 있는 플랫폼을 제공한다. 특정 전구체로부터 순수한 세포군을 생성할 수 있는 능력은 세포 계통 특이적 기여와 질병을 분리하여 연구할 수 있게 하며, 이는 재생 의학 및 발생 생물학의 공백을 메워준다.