Adrenomedullary Organoids Derived from Neural Crest and Schwann Cell Precursors

技術要約：神経堤およびシュワン細胞前駆体に由来する副腎髄質オルガノイド

問題提起
副腎髄質はストレス応答に不可ズであり、クロム親和性細胞（ChrC）を介してカテコールアミン（エピネフリンおよびノルエピネフリン）を分泌する。近年の発生生物学の研究により、ChrCの起源に関する理解が改訂され、2つの異なる神経堤由来の前駆細胞が特定された。すなわち、髄質の約20〜25%を寄与する初期交感神経・副腎前駆細胞（SAP）と、残りの75〜80%を寄与する後期のシュワン細胞前駆細胞（SCP）である。この知見にもかかわらず、特定の前駆細胞源から純粋かつ機能的なChrC集団を生成できる、指向性のある分化プロトコルは不足している。既存のヒト多能性幹細胞（hPSC）分化法は、混合集団を生成するか、SCPの寄与に対処できていないか、あるいは不完全な機能プロファイル（例：エピネフリン合成能の欠如）を持つ細胞を生成している。さらに、SAP由来およびSCP由来のChrC間の機能的な違い、特にストレス下でのカテコールアミン放出プロファイルについては、ヒトの系において未解明である。

方法論
著者らは、hPSCを用いて2つの異なる経路を通じて副腎髄質オルガノイドを生成する、指向性のある分化プロトコルを確立した。

1. SAP経路： hPSCを神経堤細胞へと分化させ、レチノイン酸（RA）を用いて後方化することで体幹アイデンティティを確立し、BMP4、SDF1、およびNRG1を用いてSAP（Day 10）を誘導した。これらのSAPをスフェロイドとして拡大培養し、その後、BMP4、アスコルビン酸、NRG1、IGF2、NGF、FGF2、デキサメタゾン、およびPMAを含む特定の培地カクテルを用いてChrCへと分化させた。
2. SCP経路： hPSCを神経堤細胞へと分化させ、FGF2、WNT、およびNRG1を用いて16日間、SCP形成に適した状態に維持した。その後、これらのSCPに対して、SAP経路で使用したものと同じChrC分化・成熟培地を適用した。
3. 混合培養： 生理的な副腎髄質の組成を模倣するため、SAPとSCPの前駆細胞を20:80の割合で混合した。
4. 特性評価： 生成されたオルガノイドに対し、成熟ChrCマーカー（TH、DBH、PNMT、Chromogranin A/B）の発現およびカテコールアミン放出を評価するために、免疫蛍光染色、RT-qPCR、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いた。機能アッセイには、カルシウムイメージング、H295R副腎皮質細胞に対するコルチゾル刺激のためのELISA、および細胞の移動と統合を評価するためのニワトリ胚へのin vivo移植を用いた。
5. 単一細胞トランスクリプトミクス： SAP、SCP、および混合培養に由来するDay 30のオルガノイドに対してscRNA-seqを実施し、発生軌跡をマッピングして細胞サブタイプを特定した。これらのデータは、再解析されたヒト胎児副腎データ（妊娠9週目）と相関させた。

主な結果

• 機能的オルガノイドの生成： SAP由来およびSCP由来の両方のプロトコルは、成熟ChrCマーカー（TH、DBH、PNMT、Chromogranin A/B）を発現し、アセチルコリン（ACh）およびPACAPによる刺激に対してノルエピネフリン（NE）およびエピネフリン（EPI）を放出可能な、3D副腎髄質オルガノイドの生成に成功した。
• 生体内統合： ニワトリ胚に移植した際、SAP前駆細胞は特異的にメソネフロス／副腎髄質領域へと移動した。成熟したSAP由来オルガノイド（Day 30）は、ヒト細胞がEPIを共発現していることを伴って、ニワトリの副腎組織へと統合された。これにより、in vivoでの統合能力が確認された。
• 発生学的可塑性：
  • SAPs： ChrCへと効率的に分化したが、可塑性は限定的であり、交感神経ニューロンおよびシュワン細胞への分化効率は非常に低かった（それぞれ約10%および約5%）。
  • SCPs： ChrC、シュワン細胞、および副交感ニューロンへと効率的に分化した（既報の通り）。しかし、SCPsは交感神経ニューロンを効率的に生成しなかった。生成された末梢ニューロン（PRPH+）は約7%であり、そのうち交感神経の特性を示すものはわずか約7%であった。これは、生成されたニューロンの大部分が非交感神経性（例：腸管または副交感神経性）であることを示唆している。
• トランスクリプトーム・サブタイプ： scRNA-seqにより、4つの異なるChrCクラスターが明らかになった。
  • SCP由来： 主にChrC2およびChrC3クラスター（97–99%）へと分化した。これらは標準的なマーカーを発現しているが、PNMTを欠いている（したがって、この特定のクラスターの文脈ではEPI生成能力を欠く）。
  • SAP由来： 主に新規のChrC1クラスター（84.5%がSAP由来）へと分化した。このクラスクターは高レベルのPNMT発現とAGTR1およびCLDN11の存在を特徴とするが、THやDBHといった標準的なマーカーは欠いている。このクラスターは、ヒトの胎児データで見られる新規のChrC様集団と相関している。
• ストレス下での機能的分離： 基底状態のNE/EPI放出は類似していたが、ストレス刺激によって異なるプロファイルが示された。SAP由来のChrCはより高いレベルのPNMTを発現し、ストレス下でより多くのEPIを放出した。対照的に、SCP由来のChrCはより高いレベルのDBHを発現し、主にNEを放出したが、EPIの放出は低いPNMT発現によって制限されていた。

主要な貢献

1. プロトコルの開発： 本研究は、hPSCから両方のSAPおよびSCP経路を介して、機能的なヒト副腎髄質オルガノイドを生成するための、初の指向性のある分化プロトコルを提供する。また、混合培養モデルも提供する。
2. 発生学的検証： 本研究は、ヒトのin vitro系において、副腎髄質の二重の起源に関する最近のin vivoの知見を検証し、SCPsがChrCの主要なソースである一方で、SAPsがより小さく独特なサブセットに寄与することを裏付けた。
3. 新規サブタイプの発見： 標準的なChrCとは転写学的に異なり、胎児集団と相関する、新規のSAP由来ChるCサブタイプ（ChrC1/CLDN11+/AGTR1+）を特定した。
4. 機能的特化： 発生学的起源が機能的出力（functional output）を決定することを示した。すなわち、SAP由来の細胞はEPI放出（深刻なストレス応答）に特化し、SCP由来の細胞はNE放出（日常的なストレス応答）に特化している。

意義
著者らは、これらの副腎髄質オルガノイドが、ChrCの発達、細胞間相互作用、および神経芽細胞腫や褐色細胞腫などの副腎疾患を研究するための、価値あるヒト関連モデルを提供すると主張している。副腎髄質の明確な発生学的起源と機能的特化を再現することにより、これらのオルガノイドは、副腎の発達を駆動する分子メカニズムや、新たな治療法のスクリーニングのためのプラットフォームを提供する。特定の前駆細胞から純粋な集団を生成できる能力は、副腎の機能および疾患への系統特異的な寄与を解明することを可能にし、現在の再生医療および発生生物学におけるギャップを埋めるものである。