🧬 생물학

Potential of Endophytic Fungi from Orobanche spp. as Novel Sources of L-Asparaginase, an Enzyme with Anticancer Applications

이 연구는 오로반케(Orobanche) 종에서 분리된 내생 균류를 항암 효소인 L-아스파라기나제의 유망한 공급원으로 규명하였으며, 특히 알테르나리아 롱이페스(Alternaria longipes) SH 25가 pH 5.0 및 1.5%의 L-아스파라긴 농도라는 특정 조건 하에서 최적의 생산량(5.95 U/mL)을 보였다.

원저자: Robabeh Gholizadeh, Roghayeh Hemmati

게시일 2026-10-13

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CC BY 4.0

원저자: Robabeh Gholizadeh, Roghayeh Hemmati

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건강한 식물 내부의 숨겨진 세계에는 미생물들이 숙주에게 해를 끼치지 않고 공간을 공유하며 조용히 살아가는 작은 곰팡이들이 살고 있습니다. 이들은 생존하고 번성하기 위해 방대한 종류의 화학적 도구를 만들어내도록 진화한 다양한 미생물 공동체인 내생균(endophytes)입니다. 이 곰팡이들이 만들어내는 많은 물질 중 하나인 효소는 특정 화학 반응을 가속화하는 생물학적 기계입니다. L-아스파라기네이스(L-asparaginase)라고 알려진 이 효소는 단백질의 특정 구성 요소인 L-아스파라진을 분해하는 중요한 역할을 하며 현대 의학에서 핵심적인 도구가 되었습니다. 이 효소는 혈액 속의 L-아스파라진을 분해합니다. 인체의 대부분 세포는 이 구성 요소를 스스로 만들어낼 수 있지만, 급성 림프구 백혈병이라 불리는 유형의 혈액암과 관련된 특정 암세포는 스스로 만들지 못합니다. 이 암세포들은 전적으로 혈액으로부터 이를 훔쳐오는 것에 의존합니다. 의사들이 환자의 체내에 이 효소를 도입하면, 이 필수 영양소를 제거하여 건강한 세포에는 거의 영향을 주지 않으면서 암세포를 굶겨 죽일 수 있습니다. 현재 의료계는 주로 박테리아로부터 이 생명을 구하는 효소를 생산하지만, 이러한 박테리아 버전은 때때로 환자에게 심각한 알레르기 반응이나 기타 부작로를 유발할 수 있어, 과학자들은 더 부드럽고 적합한 원천을 찾기 위해 노력하고 있습니다.

이란 자잔드 대학교의 연구팀은 이러한 미세한 이웃들의 독특하고 종종 간과되는 숙주인 오리나무(broomrape, 혹정근)에 주목했습니다. 대부분의 식물이 토양에서 자라는 것과 달리, 오리나무는 홀로파사이트(holoparasite, 전기생식물)로, 스스로 잎이나 뿌리가 없으며 다른 작물의 뿌리에 붙어 그 영양분을 훔치며 생존합니다. 이러한 독특하고 스트레스가 많은 생활 방식 때문에, 오리나무 안에 사는 곰팡이는 환경에 대처하기 위한 특별한 능력을 발달시켰을지도 모릅니다. 연구진은 이란 북서부 농경지에서 건강한 오리나무 샘플을 수집하여 표면의 흙이나 박테리아를 제거하기 위해 정성껏 세척했습니다. 그런 다음 식물 줄기를 작은 조각으로 잘라 영양분이 풍부한 젤리 위에 올려두고 내부에서 어떤 곰팡이가 자라나오는지 관찰했습니다. 300개의 식물 샘플 중에서 연구진은 수십 가지의 서로 다른 곰팡이 균주를 성공적으로 분리해냈으며, 현미경으로 관찰한 형태에 따라 최종적으로 34가지의 뚜렷한 유형으로 분류했습니다.

이 곰팡이들 중 어떤 것이 암과 싸우는 효소를 생산할 수 있는지 알아내기 위해, 과학자들은 먼저 간단한 시각적 테스트를 사용했습니다. 그들은 L-아스파라진과 pH 지시약이 포함된 특수 플레이트에서 곰팡이를 배양했습니다. 만약 곰팡이가 효소를 생성한다면, 아스파라진을 분해하여 암모니아를 방출하게 되고, 이는 주변 영역을 노란색에서 분홍색으로 변화시킵니다. 34가지 곰팡이 유형 중 약 20가지가 이러한 분홍색 후광(halo)을 만들어냈으며, 이는 해당 곰팡이들이 효소를 만들 능력이 있음을 시사했습니다. 그러나 연구진은 플레이트 위의 커다란 분홍색 원이 항상 높은 양의 효소 생산을 의미하는 것은 아니라는 점을 알고 있었습니다. 정확한 측정을 위해, 그들은 가장 유망한 후보들을 액체 배양으로 옮겨 암모니아가 얼마나 방출되는지를 정밀하게 측정하는 화학적 방법을 사용했습니다. 결과는 폭넓은 활성 범위를 보여주었습니다. 일부 곰팡이는 매우 적은 양을 생산한 반면, 네 가지 특정 균주가 가장 생산성이 높은 것으로 나타났습니다. 그중에서도 Alternaria longipes로 식별된 균주, 특히 SH25라고 명명된 균주는 밀리리터당 5.79 유닛에 달하는 가장 높은 효소량을 생산했습니다. 이는 Macrophomina phaseolina나 Aspergillus flavus와 같은 다른 상위 성과자들보다 현저히 높은 수치였습니다.

연구팀은 그다음으로 뛰어난 성과를 보인 Alternaria longipes SH25에 집중하여, 환경을 변화시킴으로써 효소를 더 많이 생산할 수 있는지 테스트했습니다. 그들은 가용 영양분의 양과 액체의 산도(acidity)가 생산량에 어떤 영향을 미치는지 시험했습니다. 연구 결과, 액체가 약간 산성을 띠고 특정 농도의 L-아스파라진을 포함하고 있을 때 곰팡이가 가장 많은 효소를 생산한다는 것을 발견했습니다. 이러한 최적화된 조건 하에서 효소 출력은 밀리리터당 5.95 유닛까지 상승했습니다. 또한 연구진은 산업적 활용을 위한 중요한 요소인 열 노출에 대해 효소가 얼마나 잘 견디는지 확인했습니다. 그들은 이 효소가 온도가 적당할 때 매우 안정적이며, 35도씨에서 30분 동안 유지한 후에도 거의 모든 활성을 유지하고, 2시간 후에도 여전히 약 3분의 2의 효능을 유지한다는 것을 발견했습니다. 이는 이 효소가 제조 공정에서 즉시 파괴되지 않고 다뤄질 수 있을 만큼 견고하다는 것을 시사합니다.

이 연구는 기생 식물인 오리나무가 이 중요한 효소를 생산할 수 있는 곰팡이의 풍부하면서도 이전에 탐구되지 않았던 원천임을 결론짓습니다. 고성능 Alternaria longipes 균주의 발견은 현재 의학계에서 사용되는 박테리아 원천에 대한 잠재적인 새로운 대안을 제공합니다. 박테리아 버전은 일부 환자에게 면역 반응을 일으킬 수 있는 반면, 곰팡이 효소는 종종 인체와 더 잘 호환되는 것으로 간주되지만, 이 장점을 확증하기 위해서는 추가적인 테스트가 필요합니다. 연구진은 초기 테스트 플레이트에서의 분홍색 후광 크기가 액체 배양에서 실제로 얼마나 많은 효소를 생산할지를 예측하는 신뢰할 만한 지표가 아니라는 점을 언급하며, 시각적 추측보다 정밀한 화학적 측정의 중요성을 강조했습니다. 연구팀은 유전자 서열 분석을 통해 이 곰팡이들을 분리 및 식별함으로써 그 정체를 확인하고, 이 특정 곰 fungal 종과 효소 생산 능력 사이의 명확한 연결 고리를 확립했습니다. 이 작업은 생명공학의 새로운 문을 열어주며, 우리 들판의 가장 특이한 식물조차 질병과 싸우는 데 도움을 줄 수 있는 미세한 동맹을 품고 있을 수 있음을 시사합니다.

기술 요약: Orobanche spp. 유래 내생 균류의 신규 L-아스파라기네이스(L-Asparaginase) 공급원으로서의 잠재력

문제 제기
L-아스파라기네이스(L-ASNase)는 급성 림프구 성 백혈병(ALL) 및 특정 림프종 치료에 사용되는 핵심적인 치료 효소이다. 이 효소는 L-아스파라진을 L-아스파르트산과 암모니아로 가수분해하여, L-아스파라진 합성 효소 수치가 낮아 이를 스스로 합성하지 못하는 백혈병 세포로부터 필수 아미노질을 차단하는 방식으로 작용한다. 현재 상업용 L-ASNase는 주로 박테리아(Escherichia coli 및 Dickeya chrysanthemi)에서 유래하지만, 이러한 박테리아 기원들은 과민 반응, 면역원성, 간 독성을 포함한 부작용과 자주 연관된다. 따라서 더 나은 생체 적합성과 낮은 면역원성을 제공할 수 있는 대안적인 미생물원, 특히 균류 균주를 식별하는 것이 시급한 과제이다. 약용 식물에 서식하는 내생 균류는 이미 탐구된 바 있으나, 홀로파라사이트(holoparasitic, 전기생) 식물, 특히 Orobanche spp.(오로반케, 마가목류)에 서식하는 내생 균류 공동체는 그 독특한 생태적 적응과 잠재적인 새로운 대사 능력에도 불구하고 여전히 미개척 영역으로 남아 있다.

연구 방법론
본 연구는 북서부 이란에서 수집된 Orobanche spp.로부터 내생 균류를 분리, 식별 및 평가하기 위해 다단계 접근 방식을 채택하였다:

분리 및 멸균: 300개의 건강한 식물 샘플(줄기 및 꽃)을 70% 에탄올과 1% 나트륨 하이포클로라이트로 표면 멸균하였다. 멸균 여부는 세척수를 PDA에 도말하여 확인하였다. 내생 균류를 분리하기 위해 식물 조각을 스트렙토마이신이 첨가된 감자 데크스트로스 한천(PDA)에서 배양하였다.
분자 식별: 34개의 서로 다른 형태형(morphotypes)으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 식별은 ITS 영역과 단백질 코딩 유전자(TEF1-α 및 β-tubulin)의 PCR 증폭을 통해 수행되었으며, 이후 NCBI 데이터베이스를 대상으로 한 Sanger 시퀀싱 및 BLAST 분석을 실시하였다.
정성적 스크리닝: 분리 균주들을 L-아스파라진과 페놀 레드(phenol red)가 포함된 변형 Czapek Dox 한정 배지(McDox)에서 스크리닝하였다. L-ASNase 생성은 암모니아 방출 및 pH 상승에 따른 분홍색 헤일로(halo) 형성을 통해 나타났다.
정량적 분석: 액체 배양에서 Nessler법을 사용하여 효소 활성을 정량화하였다. 배양물은 변형된 Czapek Dox 배지에서 배양되었으며, 방출된 암모니아는 450 nm에서 흡광 광도계로 측정되었다. 활성은 밀리리터당 단위(U/mL)로 표시되었다.
최적화: 가장 높은 성능을 보인 분리 균주인 Alternaria longipes SH25를 대상으로 $2^2$ 완전 요인 실험 설계를 적용하여 L-ASNase 생산을 최적화하였다. 변수에는 L-아스파라진 농도(0.5% 및 1.5%)와 pH(5.0 및 7.0)가 포함되었다.
안정성 테스트: 최적화된 분리 균주로부터 얻은 효소의 열 안정성을 35°C에서 최대 120분 동안 배양하여 평가하였다.

주요 결과

분리 및 다양성: 300개의 샘플로부터 125개의 분리 균주를 얻었으며, 이는 34개의 형태형을 나타냈다. 분자 분석 결과 Alternaria longipes, A. alternata, Fusarium verticillioides, Aspergillus flavus, Macrophomina phaseolina 등의 종이 식별되었다.
스크리닝 불일치: 정성적 스크리닝을 통해 분홍색 헤일로를 형성하는 20개의 분리 균주를 확인하였다. 그러나 헤일로 직경과 실제 효소 활성 사이에는 약하고 유의하지 않은 상관관계가 발견되었다. 예를 들어, Fusarium clavum(SH4)은 가장 큰 헤일로(3.50 cm)를 생성했으나 실제 정량적 활성은 낮았다(1.08 U/mL).
효소 생산: 정량적 분석 결과 L-ASNase 활성은 0에서 5.79 U/mL 사이로 나타났다. Alternaria longipes SH25 분리 균주가 가장 높은 활성(5.79 U/mL)을 보였으며, Macrophomina phaseolina(3.30 U/mL)와 Fusarium verticillioides(2.24 U/mL)가 그 뒤를 이었다.
최적화: $2^2$ 요인 설계를 사용하여 A. longipes SH25의 L-ASNase 생산을 최적화하였다. 최대 활성인 5.95 U/mL는 pH 5.0과 1.5% L-아스파라진 농도에서 달성되었다. 통계 분석 결과, L-아스파라진 농도는 유의미한 효과를 가졌으며( $p=0.011$ ), pH와 농도 사이의 상호작용 또한 유의미했다( $p=0.029$ ).
열 안정성: 해당 효소는 35°C에서 양호한 열 안정성을 보였으며, 30분 후에는 99.36%의 활성을 유지했고 120분 후에는 약 69%를 유지하였다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 L-ASNase 생산을 위한 Orobanche spp.와 관련된 내생 균류의 다양성을 조사한 첫 번째 연구라고 주장한다. 주요 기여는 홀로파라사이트 식물로부터 유래한 내생 균류인 Alternaria longipes SH25를 강력한 L-ASNase 생산원으로 식별한 것이다.

본 논문은 Orobanche의 독특한 생태적 지위—즉, 의무 기생 식물이라는 점—가 내생 균류의 특화된 대사 메커니즘 발달을 유도하여 가치 있는 효소 생산으로 이어질 수 있다고 상정한다. 연구는 Orobanche가 흔히 파괴적인 잡초로 간주되지만, 그 안에 생명공학적 잠재력이 큰 균류 공동체를 품고 있다는 점을 강조한다. 저자들은 A. longipes SH25가 유리한 안정성과 생산 특성을 가진 곰팡이 유래 효소를 제공함으로써, L-ASNase의 대안적 공급원으로서 추가 개발될 수 있는 유망한 후보임을 결론지으며, 이는 제약 분야의 응용을 위한 중요한 근거가 된다. 본 연구는 정확한 효소 평가를 위해 정량적 분석이 정성적 스크리닝보다 필수적임을 강조하며, 효소 발견을 위해 미개척된 기생 식물의 균류 공동체 탐사가 필요함을 역설한다.

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