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Potential of Endophytic Fungi from Orobanche spp. as Novel Sources of L-Asparaginase, an Enzyme with Anticancer Applications

Este estudo identifica fungos endofíticos isolados de espécies de *Orobanche* como fontes promissoras da enzima anticâncer L-asparaginase, com a *Alternaria longipes* SH 25 apresentando produção ótima (5,95 U/mL) sob condições específicas de pH 5,0 e concentração de 1,5% de L-asparagina.

Autores originais: Robabeh Gholizadeh, Roghayeh Hemmati

Publicado 2026-10-13

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CC BY 4.0

Autores originais: Robabeh Gholizadeh, Roghayeh Hemmati

Artigo original sob licença CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). ⚕️ Esta é uma explicação gerada por IA de um preprint que não foi revisado por pares. Não é aconselhamento médico. Não tome decisões de saúde com base neste conteúdo. Ler aviso legal completo

No mundo oculto dentro de plantas saudáveis, fungos minúsculos vivem como vizinhos silenciosos, compartilhando espaço com seus hospedeiros sem causar danos. Estes são endófitos, uma comunidade diversificada de microrganismos que evoluíram para produzir uma vasta gama de ferramentas químicas para sobreviver e prosperar. Entre as muitas substâncias que esses fungos criam estão as enzimas, que são máquinas biológicas que aceleram reações químicas específicas. Uma dessas enzimas, conhecida como L-asparaginase, tornou-se uma ferramenta crítica na medicina moderna. Ela funciona decompondo um bloco de construção específico de proteínas chamado L-asparagina. Embora a maioria das células no corpo humano possa produzir seu próprio suprimento desse bloco de construção, certas células cancerígenas, particularmente aquelas envolvidas em um tipo de câncer de sangue chamado leucemia linfoblástica aguda, não conseguem. Elas dependem inteiramente de roubar esse nutriente do sangue. Ao introduzir a enzima no sistema de um paciente, os médicos podem remover esse nutriente essencial, fazendo com que as células cancerosas morram de fome enquanto deixam as células saudáveis praticamente inalteradas. Atualmente, a indústria médica produz essa enzima vital principalmente a partir de bactérias, mas essas versões bacterianas podem, às vezes, desencadear reações alérgicas graves ou outros efeitos colaterais nos pacientes, levando cientistas a buscar fontes mais suaves e compatíveis.

Uma equipe de pesquisadores da Universidade de Zanjan, no Irã, voltou sua atenção para um hospedeiro incomum e frequentemente negligenciado para esses vizinhos microscópicos: a planta broomrape (cipó-de-espinho). Ao contrário da maioria das plantas que crescem no solo, o broomrape é um holoparasita, o que significa que não possui folhas ou raízes próprias e sobrevive inteiramente conectando-se às raíções de outras culturas e roubando seus nutrientes. Devido a esse estilo de vida único e estressante, os fungos que vivem dentro do broomrape podem ter desenvolvido habilidades especiais para lidar com seu ambiente. Os pesquisadores coletaram amostras de plantas de broomrape saudáveis de campos agrícolas no noroeste do Irã e as limparam cuidadosamente para remover qualquer sujeira ou bactéria da superfície. Eles então cortaram os caules das plantas em pequenos pedaços e os colocaram em uma gelatina rica em nutrientes para ver se algum fungo cresceria de dentro deles. De 300 amostras de plantas, eles isolaram com sucesso dezenas de diferentes linhagens fúngicas, eventualmente agrupando-as em 34 tipos distintos com base em sua aparência sob o microscópio.

Para descobrir quais desses fungos poderiam produzir a enzima anticâncer, os cientistas primeiro usaram um teste visual simples. Eles cultivaram os fungos em uma placa especial contendo L-asparagina e um corante indicador de pH. Se um fungo produzisse a enzima, ele decomporia a asparagina e liberaria amônia, o que tornaria a área circundante de amarelo para rosa. Cerca de 20 dos 34 tipos de fungos criaram esses halos rosas, sugerindo que eram capazes de produzir a enzima. No entanto, os pesquisadores sabiam que um grande círculo rosa em uma placa nem sempre significa que uma grande quantidade de enzima está sendo produzida. Para obter a medida real, eles transferiram os candidatos mais promissores para culturas líquidas e usaram um método químico para contar precisamente quanta amônia era liberada. Os resultados mostraram uma ampla gama de atividade. Enquanto alguns fungos produziam muito pouco, quatro linhagens específicas se destacaram como as mais produtivas. Entre elas, um fungo identificado como Alternaria longipes, especificamente uma linhagem rotulada como SH25, produziu a maior quantidade de enzima, atingindo 5,79 unidades por mililitro. Isso foi significativamente superior aos outros principais desempenhos, que incluíam espécies como Macrophomina phaseolina e Aspergillus flavus.

A equipe então focou na estrela do desempenho, a Alternaria longipes SH25, para ver se poderiam fazê-la produzir ainda mais enzima alterando seu ambiente. Eles testaram como a disponibilidade de alimento e a acidez do líquido afetavam a produção. Descobriram que o fungo produzia a maior quantidade de enzima quando o líquido era levemente ácido e continha uma concentração específica de L-asparagina. Sob essas condições otimizadas, a produção de enzima subiu para 5,95 unidades por mil mililitro. Os pesquisadores também verificaram quão bem a enzima resistia à exposição ao calor, um fator crucial para o uso industrial. Eles descobriram que a enzima permanecia muito estável em temperaturas moderadas, retendo quase toda a sua atividade após ser mantida a 35 graus Celsius por meia hora, e ainda mantendo cerca de dois terços de seu poder após duas horas. Isso sugere que a enzima é robusta o suficiente para ser manuseada em um ambiente de fabricação sem se decompor imediatamente.

O estudo conclui que a planta parasitária broomrape é uma fonte rica, porém anteriormente inexplorada, de fungos capazes de produzir esta enzima vital. A descoberta da linhagem de alto desempenho Alternaria longipes oferece uma potencial nova alternativa às fontes bacterianas usadas atualmente na medicina. Enquanto as versões bacterianas podem causar reações imunológicas em alguns pacientes, as enzimas fúngicas são frequentemente consideradas mais compatíveis com o corpo humano, embora testes adicionais sejam necessários para confirmar essa vantagem. Os pesquisadores observaram que o tamanho do halo rosa nas placas de teste iniciais não era um preditor confiável de quanta enzima o fungo realmente produziria em uma cultura líquida, destacando a importância de medições químicas precisas sobre suposições visuais. Ao isolar e identificar esses fungos usando sequenciamento genético, a equipe confirmou suas identidades e estabeleceu uma ligação clara entre esta espécie fúngica específica e sua capacidade de produzir a enzima. Este trabalho abre uma nova porta para a biotecnologia, sugerindo que mesmo as plantas mais incomuns em nossos campos podem abrigar aliados microscópicos capazes de ajudar a combater doenças.

Resumo Técnico: Potencial de Fungos Endofíticos de Orobanche spp. como Novas Fontes de L-Asparaginase

Definição do Problema
A L-asparaginase (L-ASNase) é uma enzima terapêutica crítica utilizada no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) e de certos linfomas. Ela funciona hidrolisando a L-asparagina em L-ácido aspártico e amônia, privando as células leucêmicas de um aminoácido essencial que elas não conseguem sintetizar devido aos baixos níveis de L-asparagina sintetase. Embora a L-ASNase comercial seja derivada principalmente de bactérias (Escherichia coli e Dickeya chrysanthemi), essas fontes bacterianas estão frequentemente associadas a efeitos adversos, incluindo hipersensibilidade, imunogenicidade e hepatotoxicidade. Consequentemente, há uma necessidade premente de identificar fontes microbianas alternativas, particularmente linhagens fúngicas, que possam oferecer melhor biocompatibilidade e menor imunogenicidade. Embora os fungos endofíticos de plantas medicinais tenham sido explorados, as comunidades endofíticas que habitam plantas holoparasitas, especificamente Orobanche spp. (erva-de-dentro), permanecem amplamente inexploradas, apesar de suas adaptações ecológicas únicas e potencial para capacidades metabólicas inéditas.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem de múltiplos estágios para isolar, identificar e avaliar fungos endofíticos de Orobanche spp. coletados no noroeste do Irã:

Isolamento e Esterilização: 300 amostras de plantas saudáveis (caules e flores) passaram por esterilização de superfície usando etanol 70% e hipoclorito de sódio 1%. A esterilidade foi verificada semeando a água de enxágue em PDA. Segmentos foram cultivados em Ágar Batata Dextrose (PDA) suplementado com estreptomicina para isolar os endofíticos.
Identificação Molecular: O DNA genômico foi extraído de 34 morfótipos distintos. A identificação foi realizada via amplificação por PCR da região ITS e genes codificadores de proteínas (TEF1-α e β-tubulina), seguida de sequenciamento Sanger e análise BLAST contra bancos de dados do NCBI.
Triagem Qualitativa: Os isolados foram triados em ágar Czapek Dox Modificado (McDox) contendo L-asparagina e vermelho de fenol. A produção de L-ASNase foi indicada pela formação de halos rosados resultantes da liberação de amônia e elevação do pH.
Ensaio Quantitativo: A atividade enzimática foi quantificada em cultura líquida utilizando o método de Nessler. As culturas foram incubadas em meio Czapek Dox modificado, e a amônia liberada foi medida espectrofotometricamente a 450 nm. A atividade foi expressa em Unidades por mililitro (U/mL).
Otimização: O isolado de maior desempenho, Alternaria longipes SH25, foi submetido a um delineamento experimental fatorial completo $2^2$ para otimizar a produção de L-ASNase. As variáveis incluíram concentração de L-asparagina (0,5% e 1,5%) e pH (5,0 e 7,0).
Teste de Estabilidade: A estabilidade térmica da enzima do isolado otimizado foi avaliada pela incubação a 35°C por até 120 minutos.

Resultados Principais

Isolamento e Diversidade: De 300 amostras, foram obtidos 125 isolados, representando 34 morfótipos. A análise molecular identificou espécies incluindo Alternaria longipes, A. alternata, Fusarium verticillioides, Aspergillus flavus e Macrophomina phaseolina.
Discrepância de Triagem: A triagem qualitativa identificou 20 isolados capazes de produzir halos rosados. No entanto, uma correlação fraca e não significativa foi encontrada entre o diâmetro do halo e a atividade enzimática real. Por exemplo, Fusarium clavum (SH4) produziu o maior halo (3,50 cm), mas exibiu baixa atividade quantitativa (1,08 U/mL).
Produção de Enzima: A análise quantitativa revelou atividade de L-ASNase variando de 0 a 5,79 U/mL. O isolado Alternaria longipes SH25 demonstrou a maior atividade (5,79 U/mL), seguido por Macrophomina phaseolina (3,30 U/mL) e Fusarium verticillioides (2,24 U/mL).
Otimização: Utilizando o delineamento fatorial $2^2$ , a produção de L-ASNase por A. longipes SH25 foi otimizada. A atividade máxima de 5,95 U/mL foi alcançada com pH 5,0 e uma concentração de L-asparagina de 1,5%. A análise estatística indicou que a concentração de L-asparina teve um efeito significativo ( $p=0,011$ ), e a interação entre pH e concentração também foi significativa ( $p=0,029$ ).
Estabilidade Térmica: A enzima exibiu boa estabilidade térmica a 35°C, retendo 99,36% de sua atividade após 30 minutos e aproximadamente 69% após 120 minutos.

Significância e Alegações
Os autores afirmam que este estudo representa a primeira investigação sobre a diversidade de fungos endofíticos associados a Orobanche spp. especificamente para a produção de L-ASNase. A principal contribuição é a identificação de Alternaria longipes SH25, um endofítico de uma planta holoparasita, como um potente produtor de L-ASNase.

O artigo postula que o nicho ecológico único de Orobanche — como um parasita obrigatório — pode impulsionar o desenvolvimento de mecanismos metabólicos especializados em seus endofíticos, levando à produção de enzimas valiosas. O estudo destaca que, embora a Orobanche seja frequentemente vista como uma erva daninha destrutiva, ela abriga uma comunidade fúngica com significativo potencial biotecnológico. Os autores concluem que A. longipes SH25 é um candidato promissor para o desenvolvimento posterior como uma fonte alternativa de L-ASNase, potencialmente oferecendo uma enzima fúngica com características de estabilidade e produção favoráveis para aplicações farmacêuticas. O trabalho ressalta a necessidade de ensaios quantitativos sobre a triagem qualitativa para uma avaliação enzimática precisa e defende a exploração de comunidades fúngicas inexploradas em plantas parasitas para a descoberta de enzimas.

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