Expanding the flavonoid production in Acinetobacter baylyi ADP1 from lignin-derived aromatics

식물은 태양으로부터 자신을 보호하고, 감염과 싸우며, 색을 입히기 위해 끊임없이 복잡한 분자를 만들어내는 숙련된 화학자입니다. 이러한 화학적 창조물 중에는 과일, 채소, 꽃에서 발견되는 다양한 계열의 화합물인 플라보노이드가 있습니다. 인간은 오랫동안 식품, 의약품, 화장품에 사용하며 이 물질들의 잠재적인 건강 효능을 가치 있게 여겨왔습니다. 수십 년 동안 플라보노이드를 얻는 주요 방법은 식물에서 추출하거나 실험실에서 처음부터 합성하는 것이었습니다. 두 방법 모두 상당한 단점이 있습니다. 작물에서 추출하는 것은 종종 비효율적이고 계절의 영향을 받으며, 화학적 합성은 비용이 많이 들고 환경에 부담을 줄 수 있습니다.

최근 몇 년 동안 과학자들은 이 화합물들을 생산하기 위해 미생물이라는 아주 작은 살아있는 공장에 눈을 돌렸습니다. 박테리아나 효모에 식물 유전자를 삽입함으로써, 연구자들은 이 세포들이 특정 플라보노이드를 제조하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 그러나 이러한 대부분의 미생물 공장은 포도당과 같은 단순한 당을 먹이로 삼습니다. 설탕을 플라보노이드로 바꾸기 위해 미생물은 먼저 기초적인 방향족 고리 구조를 처음부터 구축해야 하는데, 이 과정은 많은 유전적 단계와 많은 세포 에너지를 소모합니다. 이는 과정을 길고 통제하기 어렵게 만듭니다. 더 직접적인 접근 방식은 미생물에게 필요한 방향족 구성 요소를 직접 먹여서 초기 구축 단계를 건너뛰는 것입니다. 자연은 나무의 견고함을 주는 질긴 목질성 고분자인 리그닌 안에 이러한 블록들을 풍부하게 제공합니다. 나무가 분해될 때, 식물이 플라보노이드를 만드는 데 사용하는 전구체와 화학적으로 매우 유사한 방향족 화합물 혼합물이 방출됩니다. 문제는 나무의 이 단단한 방향족 화합물을 먹을 수 있을 뿐만 아니라, 나무를 분해하는 가혹한 조건에서도 견딜 수 있으면서, 동시에 생산을 위해 공학적으로 조작하기 쉬운 미생물을 찾는 것이었습니다.

핀란드 탐페레 대학교의 연구팀은 아시네토박터 바이리(Acinetobacter baylyi) ADP1이라는 박테리아를 활용하여 이 과제를 성공적으로 해결했습니다. 이 연구에서 흔히 사용되는 일반적인 실험실 박테리아와 달리, 이 생물은 나무에서 발견되는 다양한 방향족 화합물을 소비할 수 있는 능력을 천연적으로 갖추고 있습니다. 연구진은 이 나무 유래 물질을 직접 플라보노이드로 전환하는 능력을 활용할 수 있는지 확인하고자 했습니다. 그들의 목표는 새로운 제품을 만들 때마다 박테리아의 유전 코드를 다시 프로그래밍할 필요 없이, 제공하는 나무 유래 먹이의 종류만 바꿈으로써 다양한 유형의 플라보노이드를 생산할 수 있는 단일 미생물 플랫폼을 만드는 것이었습니다.

연구팀은 먼저 박테리아가 식품 및 의약품에 자주 사용되는 특정 플라보노이드인 호모에리오디티올(homoeriodictyol)을 생산하도록 할 수 있는지 테스트했습니다. 이 분자는 일반적으로 페룰레이트(ferulate)라고 불리는 전구체로부터 만들어집니다. 연구진은 처음에 박테리아의 기존 효소를 수정하여 페룰레이트를 받아들일 수 있게 함으로써, 세포가 이 새로운 성분을 처리할 수 있도록 작은 유전적 조정을 시도했습니다. 그들은 플라보노이드 구조를 만드는 데 책임이 있는 특정 부분의 효소를 변경했지만, 이는 작동하지 않았습니다. 박테리아가 원하는 분자를 생성할 수 없었던 것입니다. 미세한 수정만으로는 불충분하다는 것을 깨달은 연구진은 전략을 전환했습니다. 기존 효소를 수정하는 대신, 페룰레이트를 다룰 수 있는 능력이 자연적으로 있는 다른 식물 종의 다른 버전의 효소를 찾았습니다. 그들은 스테놀로마 추사눔(Stenoloma chusanum)이라는 식물에서 일치하는 것을 발견했습니다. 박테리아의 원래 효소를 이 새로운 식물 효소로 교체했을 때, 박테리아는 즉시 호모에로디티올을 생산하기 시작했습니다. 이 발견은 때때로 가장 효과적인 해결책은 기존의 도구를 새로운 일을 하도록 강요하는 것이 아니라, 이미 그 일을 위해 설계된 도구를 찾는 것임을 강조했습니다.

이 새로운 효소 조합을 갖춘 상태에서, 연구진은 생산량을 극대화하기 위해 배양 조건을 최적화했습니다. 그들은 박테리아에게 적당량의 전구체를 공급하고 특정 온도에서 배양할 때 가장 잘 수행된다는 것을 발견했습니다. 이러한 조건 하에서, 박테리아는 플라스크 안에서 리터당 3.7 밀리그램의 호모에로디티올을 생산했습니다. 하지만 팀은 여기서 멈추지 않았습니다. 그들은 이 동일한 설정이 다른 플라보노이드를 생산할 수 있는지 알고 싶었습니다. 그들은 배양액에 또 다른 방향족 화합물인 카페에이트(caffeate)를 도입했습니다. 놀랍게도, 정확히 동일한 유전적 설정을 가진 동일한 박테리아 균주가 기어를 바꾸어 에리오디티올(eriodictyol)이라는 다른 플라보노이드를 생산하기 시작했습니다. 이 경우, 박테리아는 이전보다 훨씬 많은 양인 리터당 24.2 밀리그램을 생산했습니다. 이는 박테리아의 산출물이 전적으로 제공된 먹이에 의해 결정된다는 것을 보여주었습니다. 페룰레이트를 먹이면 한 가지 제품을 만들고, 카페에이트를 먹이면 다른 제품을 만든다는 것입니다.

더 현실적인 조건에서 시스템을 테스트하기 위해, 연구진은 산업 규모의 발효에 사용되는 더 큰 용기인 바이오리액터로 박테리아를 옮겼습니다. 그들은 박테리아에게 나무에서 발견되는 세 가지 다른 방향족 화합물인 페룰레이트, 카페에이트, p-쿠마레이트(p-coumarate)의 혼합물을 먹였습니다. 박테리아는 이 혼합된 수프를 세 가지 다른 플라보노이드의 칵테일로 성공적으로 전환했습니다. 서로 다른 경로가 자원을 두고 경쟁하기 때문에 총 생산량은 단일 성분을 공급했을 때보다 낮았지만, 결과는 이 시스템이 복잡한 혼합물을 처리할 수 있음을 증명했습니다. 이는 실제 나무 폐기물이 단일 순수 화학 물질이 아니라 복잡한 혼합물이라는 점에서 매우 중요한 단계입니다.

마지막으로, 팀은 실제 산업 부산물을 사용하여 시스템을 테스트했습니다. 그들은 밀 짚과 오가노솔프 리그닌(organosolv lignin)이라 불리는 가공된 목재를 가져와 화학적 공정으로 분해한 뒤, 그 결과물인 액체를 수집했습니다. 이 액체는 '알칼리 전처리 액(alkaline pretreated liquor)'으로 알려져 있으며, 여기에는 천연 방향족 화합물 혼합물뿐만 아니라 대부분의 박테리아에 독성이 될 수 있는 많은 불순물이 포함되어 있습니다. 연구진은 이 복잡한 액체를 박테리아 배양액에 추가했습니다. 이 무질서하고 도전적인 환경에도 불구하고, 박테리아는 번성하며 플라보노이드를 생산했습니다. 그들은 밀 짚과 리그닌 액체에 포함된 화합물들을 표적 분자로 성공적으로 전환했으며, 이는 이 시스템이 실험실의 순수 화학 물질뿐만 아니라 임업 및 농업 산업에서 발생하는 실제 폐기물 스트림에서도 작동함을 입증했습니다.

이 연구는 아시네토박터 바이리 ADP1이 지속 가능한 제조를 위한 매우 다재다연한 플랫폼이라고 결론짓습니다. 나무의 방향족 화합물을 먹는 박테리아의 자연적인 능력을 활용함으로써, 연구진은 박테리아가 이러한 구조를 처음부터 구축해야 하는 필요성을 우회했습니다. 이 접근 방식은 먹이(feedstock)에 의해 최종 제품이 결정되는 유연한 생산 시스템을 가능하게 합니다. 만약 공장에 한 종류의 나무 유래 화학 물질이 과잉 공급된다면, 박테리아에게 그것을 먹여 특정 플라보노이드를 만들 수 있고, 공급이 변하면 동일한 박테리아에게 다른 화학 물질을 먹여 다른 제품을 만들 수 있으며, 이 모든 과정에서 추가적인 유전 공학은 필요하지 않습니다. 이 연구는 흔히 연료로 태워지는 리그닌의 가치 증대와 고부가가치 천연 제품 생산 사이의 직접적인 연결 고리를 확립하며, 보다 순환적이고 효율적인 바이오 경제를 향한 유망한 길을 제시합니다.