Expanding the flavonoid production in Acinetobacter baylyi ADP1 from lignin-derived aromatics

Planten zijn meesterchemici die voortdurend complexe moleculen creëren die hen beschermen tegen de zon, infecties bestrijden en hen hun kleuren geven. Onder deze chemische creaties behoren flavonoïden, een diverse familie van verbindingen die te vinden zijn in fruit, groenten en bloemen. Mensen waarderen deze stoffen al lang om hun potentiële gezondheidsvoordelen en gebruiken ze in voedsel, medicijnen en cosmetica. Decennialang waren de primaire manieren om flavonoïden te verkrijgen het extraheren ervan uit planten of het vanaf nul opbouwen in een laboratorium. Beide methoden hebben aanzienlijke nadelen: het extraheren uit gewassen is vaak inefficiënt en beperkt door de seizoenen, terwijl chemische synthese kostbaar en milieubelastend kan zijn.

In de afgelopen jaren hebben wetenschappers zich tot microscopische levende fabrieken genaamd microben gericht om deze verbindingen te produceren. Door plantengenen in bacteriën of gisten in te brengen, kunnen onderzoekers deze cellen programmeren om specifieke flavonoïden te vervaardigen. De meeste van deze microbiële fabrieken worden echter gevoed met eenvoudige suikers, zoals glucose. Om suiker in een flavonoïde te veranderen, moet de microbe eerst een complexe aromatische ringstructuur vanaf nul opbouwen, een proces dat veel genetische stappen vereist en veel energie van de cel verbruikt. Dit maakt het proces langdurig en moeilijk te controleren. Een directere aanpak zou zijn om de microben de aromatische bouwstenen te voeren die ze nodig hebben, waardoor de initiële constructiefase wordt overgeslagen. De natuur levert deze blokken in overvloed binnen lignine, een taai, houtachtig polymeer dat bomen hun stijfheid geeft. Wanneer hout wordt afgebroken, komen er een mengsel van aromatische verbindingen vrij die chemisch zeer vergelijkbaar zijn met de precursoren die planten gebruiken om flavonoïden te maken. De uitdaging is geweest om een microbe te vinden die niet alleen deze taaie aromatische verbindingen kan eten, maar ook de harde omstandigheden van het afbreken van hout kan verdragen, terwijl deze ook gemakkelijk te modificeren is voor productie.

Een team van onderzoekers aan de Tampere Universiteit in Finland heeft dit probleem succesvol aangepakt door zich te wenden tot een bacterie genaamd Acinetobacter baylyi ADP1. In tegen tegenstelling tot de gebruikelijke laboratoriumbacteriën die vaak in deze studies worden gebruikt, bezit dit organisme van nature de machinerie om een breed scala aan aromatische verbindingen uit hout te consumeren. De onderzoekers wilden onderzoeken of ze deze natuurlijke vaardigheid konden aanwenden om lignine-afgeleide materialen direct om te zetten in waardevolle flavonoïden. Hun doel was om een enkel microbieel platform te creëren dat verschillende soorten flavonoïden kon produceren door simpelweg het type hout-afgeleid voedsel te veranderen, zonder dat de genetische code van de bacteriën voor elk nieuw product opnieuw herschreven hoefde te worden.

Het team begon met het testen of ze de bacteriën homoeriodictyol konden laten produceren, een specifieke flavonoïde die vaak in voedsel en medicijnen wordt gebruikt. Dit molecuul wordt doorgaans gemaakt van een precursor genaamd ferulaat. De onderzoekers probeerden eerst de bestaande enzymen van de bacteriën aan te passen om ferulaat te accepteren, in de hoop dat een kleine genetische aanpassing de cel in staat zou stellen dit nieuwe ingrediënt te verwerken. Ze wijzigden specifieke delen van het enzym dat verantwoordelijk is voor het opbouwen van de flavonoïde-structuur, maar deze veranderingen werkten niet; de bacteriën konden het gewenste molecuul niet produceren. Toen ze beseften dat kleine aanpassingen onvoldoende waren, veranderden ze hun strategie. In plaats van het bestaande enzym te modificeren, zochten ze naar een andere versie van het enzym uit een andere plantensoort die van nature in staat is om met ferulaat om te gaan. Ze vonden een match in een plant genaamd Stenoloma chusanum. Toen ze het oorspronkelijke bacteriële enzym vervingen door dit nieuwe plantenenzym, begon de bacterie onmiddellijk homoeriodictyol te produceren. Deze ontdekking benadrukte een kernprincipe: soms is de meest effectieve oplossing niet om een bestaand instrument een nieuwe taak op te leggen, maar om een instrument te vinden dat er al voor ontworpen is.

Met deze nieuwe enzymcombinatie op hun plaats, optimaliseerden de onderzoekers de kweekomstandigheden om de productie te maximaliseren. Ze ontdekten dat de bacteriën het beste presteerden wanneer ze een matige hoeveelheid van de precursor kregen en werden gekweekt bij een specifieke temperatuur. Onder deze omstandigheden produceerden de bacteriën 3,7 milligram per liter homoeriodictyol in een kolf. Maar het team stopte daar niet. Ze wilden zien of ditzelfde systeem ook andere flavonoïden kon produceren. Ze introduceerden een andere aromatische verbinding, caffeaat, in de cultuur. Opmerkelijk genoeg schakelde exact dezelfde stam van de bacteriën, met exact dezelfde genetische configuratie, van koers en begon een andere flavonoïde genaamd eriodictyol te produceren. In dit geval produceerden de bacteriën 24,2 milligram per liter, een aanzienlijk hogere hoeveelheid dan voorheen. Dit toonde aan dat de output van de bacteriën volledig werd bepaald door het voedsel dat ze kregen. Als ze ferulaat kregen, maakten ze één product; als ze caffeaat kregen, maakten ze een ander product.

Om het systeem onder meer realistische omstandigheden te testen, verplaatsten de onderzoekers de bacteriën naar een bioreactor, een groter vat dat wordt gebruikt voor industriële fermentatie. Ze voerden de bacteriën een mengsel van drie verschillende aromatische verbindingen uit hout: ferulaat, caffeaat en p-coumaraat. De bacteriën zetten deze gemengde soep succesvol om in een cocktail van drie verschillende flavonoïden tegelijkertijd. Hoewel de totale hoeveelheid product lager was dan wanneer er één enkel ingrediënt werd gevoed, waarschijnlijk omdat de verschillende routes met elkaar concurreerden om middelen, bewees het resultaat dat het systeem complexe mengsels aan kon. Dit is een cruciale stap, aangezien echt houtafval nooit een enkele zuivere chemische stof is, maar een complex mengsel.

Ten slotte testte het team het systeem met daadwerkelijke industriële bijproducten. Ze namen tarwestro en een type bewerkt hout genaamd organosolv-lignine, behandelden deze met een chemisch proces om ze af te breken en verzamelden de resulterende vloeistof. Deze vloeistof, bekend als alkalisch voorbehandeld extract, bevat een natuurlijk mengsel van aromatische verbindingen maar ook vele andere onzuiverheden die giftig kunnen zijn voor de meeste bacteriën. De onderzoekers voegden deze complexe vloeistof toe aan hun bacteriële culturen. Ondanks de rommelige en uitdagende omgeving gedijden de bacteriën en produceerden ze flavonoïden. Ze zetten de verbindingen die in de tarwestro en lignine-extracten aanwezig waren succesvol om in de doelmoleculen, wat bewees dat het systeem niet alleen werkt met zuivere chemicaliën in een laboratorium, maar ook met de werkelijke afvalstromen die worden gegenereerd door de bosbouw- en landbouwindustrieën.

De studie concludeert dat Acinetobacter baylyi ADP1 een zeer veelzijdig platform is voor duurzame productie. Door gebruik te maken van het natuurlijke vermogen van de bacterie om aromatische verbindingen te consumeren, hebben de onderzoekers de noodzaak om deze structuren vanaf nul op te bouwen omzeild. Deze aanpak maakt een flexibel productiesysteem mogelijk waarbij het eindproduct wordt bepaald door de grondstof. Als een fabriek een overschot heeft aan een bepaald type hout-afgeleide chemische stof, kunnen de bacteriën die krijgen gevoed om één specifiek flavonoïde te maken; als de aanvoer verandert, kan dezelfde bacterie een andere chemische stof krijgen gevoed om een ander product te maken, allemaal zonder verdere genetische modificatie. Dit werk legt een directe link tussen de valorisatie van lignine, een materiaal dat vaak als brandstof wordt verbrand, en de productie van hoogwaardige natuurlijke producten, wat een veelbelovend pad biedt naar een meer circulaire en efficiënte bio-economie.