Probing the sequence variability tolerance in a de novo α-helical barrel biocatalyst

기술 요약: 데 노보(De Novo) α-헬릭스 배럴 바이오카탈리스트의 서열 가변성 허용도 탐구

문제 제기
데 노보 설계 효소들은 새로운 단백질 골격에서 높은 촉매 활성과 열적 안정성을 입증해 왔으나, 설계된 백본-서열 쌍의 "엔지니어링 가능성(engineerability)"에 대해서는 근본적인 의문이 남아 있다. 구체적으로, 기능적인 데 노보 골격이 구조적 무결성, 안정성 또는 촉매 기능을 상실하지 않으면서 얼마나 많은 서열 변화와 구조적 재설계를 견딜 수 있는지는 불분명하다. 또한, 이러한 설계물들의 E. coli 내 수용성 단백질 생산을 개선하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있다. 본 연구는 모델 시스템으로서 촉매 활성을 가진 6개 헬릭스 배럴 골격인 6H5L을 사용하여 이러한 한계를 조사한다.

방법론
저자들은 6H5L 골격을 수정하기 위해 딥러닝(DL)과 고전적인 물리 기반 계산 설계를 결합한 이중 전략 접근법을 채택하였다:

1. 서열 재설계 (ProteinMPNN + AlphaFold2): 연구진은 활성 부위(cavity 2)를 고정시킨 상태에서, 기존에 최적화된 변이체인 6H5L_RA1의 표면 잔기와 최적화되지 않은 cavity 1을 재설계하기 위해 ProteinMPNN을 활용하였다. AlphaFold2(AF2)는 높은 pLDDT 신뢰도 점수를 기준으로 설계를 필터링하는 데 사용되었다. 실험적 특성 분석을 위해 두 가지 변이체인 6H5L_mpnn1740(pI 5.4)과 6H5L_mpnn1409(pI 7.18)가 선택되었다.
2. 구조적 절단 (RosettaRemodel + AlphaFold2): 구조적 다양화의 한계를 테스트하기 위해, 연구진은 AF2의 안내를 받아 RosettaRemodel을 통해 6H5L 골격의 절단된 버전을 생성하였다. 이는 배럴을 짧게 만들어 열린 말단(open termini)을 만드는 과정을 포함하며, 그 결과 두 가지 변이체인 6H5L_Cut(180개 아미노산)과 6H5L_Cut2(162개 아미노酸)가 생성되었다.
3. 실험적 특성 분석: 모든 변이체는 E. coli에서 발현 및 정제되었다. 이들의 특성은 다음을 통해 평가되었다:
   • 용해도 및 안정성: SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 그리고 온도 스캔을 동반한 원형 이색성(CD) 분광법.
   • 폴딩 검증: 소수성 공동(cavity)의 무결성을 조사하기 위한 DPH 형광 분석.
   • 구조적 검증: 소각 X선 산란(SAXS) 및 X선 결정학(특히 6H5L_Cut에 대해 적용, PDB: 9R2B).
   • 촉매 활성: 레트로-알돌라아제(retro-aldolase) 활성 분석, 라이신(lysine)의 무결성을 확인하기 위한 저해 분석, 그리고 전세포(whole-cell) 생물 전환 실험.

주요 결과

• 수용성 발현: ProteinMPNN 변이체인 6H5L_mpnn1740은 참조 모델인 6H5L_RA1(1.7 mg/L)에 비해 10배 증가한 수용성 단백질 수율(16.7 mg/L)을 나타냈다. 반면, 6H5L_mpnn1409는 낮은 발현율과 미스폴딩 징후를 보였다. 절단된 변이체 중에서는 6H5L_Cut이 단분산 피크를 생성한 반면, 6HL_Cut2는 응집 현상을 보였으며, 이는 낮은 AF2 신뢰도 점수와 상관관계가 있었다.
• 구mathcal적 무결성:
  • 6H5L_mpnn1740과 6H5L_Cut은 모두 특징적인 α-헬릭스 배럴 구조와 높은 열적 안정성(95°C까지 안정)을 유지했다.
  • 결정 구조 (6H5L_Cut): 결정 구조는 AF2 설계 모델과 밀접하게 일치했다 (Cα RMSD = 2.61 Å). 전반적인 배럴 구조는 보존되었으나, 결정 구조는 H5 헬릭스가 모델(1.9°)에 비해 크게 기울어져(6.3°) 한 축을 따라 번들을 확장하고 다른 축을 따라 수축시키는 이방성 변형(anisotropic deformation)을 드러냈다. 결정적으로, 중앙의 전하 잔기들의 정전기적 상호작용 네트워크는 온전하게 유지되었다.
  • DPH 분석: 6H5L_mpnn1740은 모체와 유사한 포화 프로파일을 보였으나, 더 높은 해리 상수($K_D$)를 나타내어 cavity 1의 부분적인 폐쇄를 시사했다. 6H5L_Cut은 변화된 결합 거동을 보였으나 마이크로몰 단위의 친화력을 유지한 반면, 6H5L_Cut2는 결합을 보이지 않아 미스폴딩을 확인시켜 주었다.
• 촉매 성능:
  • 6H5L_mpnn1740: 레트로-알돌라아제 활성을 유지했으나, 6H5L_RA1보다 낮은 전반적인 촉매 효율($k_{cat}/K_m$)을 보였다. 이는 높은 $k_{cat}$ (48.45 vs 27.31 $\times 10^{-4}$ min$^{-1}$)에도 불구하고, cavity 1의 재설계가 기질 결합에 영향을 미쳐 현저히 높은 $K_m$ (1580 vs 530 µM)을 유발했기 때문이다.
  • 6H5L_Cut: 원래의 6H5L(1.96 M$^{-1}$ min$^{-1}$)보다 약간 높은 촉매 효율($k_{cat}/K_m$ = 2.38 M$^{-1}$ min$^{-1}$)을 보였는데, 이는 유사한 기질 친화력을 유지하면서도 높은 $k_{cat}$을 달एको 덕분이다. 열린 말단은 두 개의 접근 가능한 결합 포켓을 허용하는 것으로 보인다.
  • 전세포 시스템: 성공적인 두 변이체 모두 효소가 없는 대조군보다 거의 두 배 높은 수준으로 기질을 소비하고 생성물을 생산하며 전세포 생물 전환에서 촉매 활성을 입증했다.

의의 및 주장
본 논문은 데 노보 α-헬릭스 배럴 골격이 높은 수준의 서열 가변성 허용도를 가지고 있다고 주장한다. 본 연구는 다음을 입증하였다:

1. 상당한 서열 변화(ProteinMPNN을 통한)를 도입함으로써 전역적 폴드(fold)나 촉매 메커니즘을 손상시키지 않고도 수용성 발현(10배 증가)을 최적화할 수 있다.
2. 주요 구조적 재설계(RosettaRemodel을 통한 절단)가 가능하며, 이를 통해 열적 안정성과 촉매 기능을 유지하면서 열린 말단을 가진 더 짧은 배럴을 만들 수 있다.
3. 방법론의 시너지: 딥러닝(ProteinMPNN/AF2)과 물리 기반 방법(RosettaRemodel)은 견고하고 고수율인 데 노보 바이오카탈리스트를 엔지니어링하는 데 서로 보완될 수 있다.
4. 예측의 한계: 6H5L_Cut2와 6H5L_mpnn1409의 실패는 AF2가 강력한 필터이긴 하지만, 특정 임계값(예: 평균 pLDDT < 90 또는 특정 저신뢰 영역) 미만의 신뢰도 점수는 실험적인 폴딩과 안정성을 항상 신뢰성 있게 예측하지 못할 수 있음을 시사한다.

궁극적으로, 이 연구는 데 노보 골격의 엔지니어링 잠재력에 대한 새로운 통찰을 제공하며, 극적인 서열 및 구조적 변화를 견디면서도 기능을 유지할 수 있는 능력을 검증함으로써 바이오카탈리시스와 지속 가능한 화학 분야에서의 적용 가능성을 확장한다.