CInvestigating the Mechanism of the Co - regulation of Colorectal Cancer by Tumor - associated Fibroblasts and Disulfidptosis Based on Single - cell RNA Sequencing and Bulk RNA Sequencing

기술 요약: CAFs와 이황화물 세포사멸(Disulfidptosis)에 의한 대장암의 공동 조절

문제 제념
대장암(CRC)은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로 남아 있으며, 근치적 수술에도 불구하고 상당한 비율의 환자들이 진행된 단계에서 진단받거나 재발을 경험한다. 종양 미세환경(TME), 특히 암 연관 섬유아세포(CAFs)가 질병 진행과 치료 저항성을 유도하는 것으로 알려져 있으나, CAFs가 이황화물 세포사멸(disulfidptosis)과 같은 신흥 형태의 세포사멸과 상호작용하는 구체적인 메커니즘은 여전히 불분명하다. 시스틴 축적과 이황화물 스트레스에 의해 유발되는 대사 관련 세포사멸인 이황화물 세포사멸은 대장암의 잠재적인 치료적 취약점을 나타내지만, CAF 활성과 이 경로를 연결하는 신뢰할 수 있는 바이오마커는 아직 확립되지 않았다.

연구 방법론
본 연구는 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 벌크 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 데이터를 결합한 다중 오믹스 통합 접근 방식을 채택하였다:

1. 데이터 소스: 벌크 RNA-seq 데이터는 TCGA-CRC 및 GEO 데이터셋 GSE87211로부터 확보하였다. scRNA-seq 데이터(GSE132257)에는 5개의 대장암 조직과 5개의 부근 정상 조직 샘플이 포함되었다. 기존 문헌으로부터 19개의 이황화물 세포사멸 관련 유전자(DRGs) 목록을 큐레이션하였다.
2. 단일 세포 분석: scRNA-seq 데이터는 품질 관리, 정규화 및 차원 축소(PCA, UMAP)를 위해 Seurat 패키지를 사용하여 처리되었다. 세포 유형은 SingleR 패키지를 사용하여 주석을 달았다. 세포 간 통신은 CellChat을 통해 분석하여 리간드-수용체 상호작용을 식별하였다. 유사 시간(Pseudotime) 분석은 CAF 분화 궤적을 매핑하기 위해 Monocle을 사용하였다.
3. 유전자 식별: scRNA-seq의 CAFs에서의 차등 발현 유전자(DEGs1)와 TCGA-CRC 벌크 데이터의 DEGs2를 식별하였다. 가중 유전자 공발현 네트워크 분석(WGCNA)을 TCGA 데이터에 적용하여 DRG 점수와 상관관계가 있는 유전자 모듈을 식별하였다.
4. 교차 및 모델링: DEGs1, DEgs2 및 WGCNA 모듈 유전자를 교차하여 CAFs와 DRGs에 의해 공동 조절되는 유전자를 식별하였다. 예후 유전자는 단변량 Cox 회귀 분석을 통해 선별되었으며, 이후 LASSO 회귀 및 다변량 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 리스크 시그니처를 구축하였다.
5. 검증 및 특성 분석: ROC 곡선, Kaplan-Meier 생존 분석, 시간 의존적 AUC를 사용하여 TCGA 및 GSE87211 코호트에서 리스크 모델을 검증하였다. 기능적 농축(GO, KEGG), 면역 침윤(CIBERSORT) 및 약물 민감도(GDSC) 분석이 수행되었다.
6. 실험적 검증: 귀주성 인민 병원의 독립적인 20명 대장암 환자 코호트를 사용하여 면역조직화학염색(IHC) 및 면역형광법(IF)을 통해 종양 대비 인접 정상 조직에서의 주요 유전자 단백질 발현 수준을 검증하였다.

주요 결과

• 세포 상호작용: scRNA-seq 분석 결과, CAFs와 내피세포는 주로 GDF15-TGFBR2 및 WNT5A-FZD4 신호 전달 축에 의해 매개되는 가장 강력한 상호적 상호작용을 보였다. CAFs는 정상 조직에 비해 대장암 샘플에서 유의하게 감소한 반면, T 세포와 대식세포는 풍부해진 것으로 나타났다.
• 유전자 교차: 127개의 CAF 특이적 DEGs, 5,535개의 벌크 DEGs, 3,627개의 WGCNA 모듈 유전자로부터 47개의 교차 유전자가 식별되었다. 기능 분석 결과, 이 유전자들은 세포 외 기질(ECM) 조직화 및 Wnt 신호 전달 경로에 농축되어 있었다.
• 예후 시그니처: 머신러닝 및 Cox 회귀 분석을 통해 두 가지 핵심 예후 유전자인 SRPX(Sushi Repeat Containing Protein X)와 PRELP(Proline Arginine-Rich End Leucine-Rich Repeat Protein)를 식별하였다. 리스크 점수 모델이 구축되었다: Risk Score = 0.122 × exp(SRPX) + 0.153 × exp(PRELP).
• 계층화 및 생존: 이 모델에 따라 고위험군과 저위험군으로 계층화된 환자들은 TCGA 및 GSE87211 코호트 모두에서 유의한 생존 차이를 보였다(P < 0.05). 모델은 3, 5, 7년 AUC 값이 0.6 이상으로 견고한 예측 성능을 입증하였다.
• 면역 상관관계: 고위험군은 M0 대식세포 침윤과 양의 상관관계(리스크 점수 r = 0.36, PRELP r = 0.44)를 보였고, 활성화된 CD4+ 기억 T 세포와는 음의 상관관계를 보였다.
• 분화 궤적: 유사 시간 분석은 세 가지 뚜렷한 CAF 분화 경로를 밝혔다. SRPX와 PRELP의 발현은 말단 분화 단계(CAF_myo, CAF_AP, CAF_adi)를 향해 점진적으로 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 이들의 상향 조절이 CAF 성숙과 관련이 있음을 시사한다.
• 실험적 확인: IHC 및 IF 분석은 SRPX와 PRELP가 인접 정상 조직에 비해 대장암 환자의 종양 영역에서 유의하게 상향 조절되었음을 확인하였으며, 가장 높은 발현 수준은 정상 섬유아세포 및 암세포와 비교했을 때 일차 CAFs에서 발견되었다.
• 치료적 함의: 약물 민감도 분석에서 고위험 환자들은 Bortezomib 및 Docetaxel을 포함한 특정 화학요법제에 대한 민감도가 증가함을 보였다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 대장암에서 CAFs와 이황화물 세포사멸 사이의 크로스토크를 체계적으로 특성화한 첫 번째 연구라고 주장한다. 단일 세포 및 벌크 전사체 데이터를 통합함으로써, 본 연구는 환자의 생존 위험을 효과적으로 계층화하는 CAF 유래 이황화물 세포사멸 관련 유전자(SRPX 및 PRELP) 기반의 새로운 예후 모델을 구축하였다.

본 논문은 SRPX와 PRELP가 CAF의 기능적 상태와 이황화물 세포사멸 사이의 분자적 연결 고리 역할을 한다고 상정한다. 저자들은 ECM 관련 유전자인 이들의 상향 조절이 (특히 M0 대식세포 침윤을 촉진하고 CD4+ 기억 T 세포를 억제함으로써) 기질 리모델링 및 면역 회피에 기여할 수 있다고 제안한다. 나아가, 본 연구는 이 유전자들이 CAFs 또는 종양 미세환경을 이황화물 세포사멸에 취약하게 만들 수 있음을 제시하며, 대장암 치료에서 기질 구획을 표적으로 하는 새로운 관점을 제공한다. 이러한 결과는 예후적 이질성을 이해하고 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위한 토대로 제시되나, 저자들은 정확한 분자적 메커니즘을 규명하기 위해서는 추가적인 실험적 설명이 필요함을 인정하였다.