CInvestigating the Mechanism of the Co - regulation of Colorectal Cancer by Tumor - associated Fibroblasts and Disulfidptosis Based on Single - cell RNA Sequencing and Bulk RNA Sequencing

Resumo Técnico: Corregulação do Câncer Colorretal por CAFs e Disulfidptosis

Definição do Problema
O câncer colorretal (CCR) continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer globalmente, com uma proporção significativa de pacientes diagnosticados em estágios avançados ou apresentando recorrência, apesar da cirurgia radical. Embora o microambiente tumoral (MET), particularmente os fibroblastos associados ao câncer (CAFs), seja conhecido por impulsionar a progressão e a resistência à terapia, os mecanismos específicos pelos quais os CAFs interagem com formas emergentes de morte celular, como a disulfidptosis, permanecem obscuros. A disulfidptosis, uma morte celular associada ao metabolismo desencadeada pelo acúmulo de cistina e estresse de dissulfeto, representa uma potencial vulnerabilidade terapêutica no CCR, contudo, biomarcadores confiáveis que liguem a atividade dos CAFs a essa via ainda não foram estabelecidos.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem integrativa multiômica combinando dados de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) e de RNA em massa (RNA-seq):

1. Fontes de Dados: Os dados de RNA-seq em massa foram obtidos do The Cancer Genome Atlas (TCGA-CRC) e do conjunto de dados GEO GSE87211. Os dados de scRNA-seq (GSE132257) incluíram 5 amostras de tecido de CCR e 5 amostras paraneoplásicas. Uma lista de 19 genes relacionados à disulfidptosis (DRGs) foi curada a partir da literatura existente.
2. Análise de Célula Única: Os dados de scRNA-seq foram processados usando o pacote Seurat para controle de qualidade, normalização e redução de dimensionalidade (PCA, UMAP). Os tipos celulares foram anotados usando o pacote SingleR. A comunicação célula-célula foi analisada via CellChat para identificar interações ligante-receptor. A análise de pseudotempo foi realizada usando Monocle para mapear as trajetórias de diferenciação de CAFs.
3. Identificação de Genes: Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados em CAFs a partir de scRNA-seq (DEGs1) e em dados de RNA-seq em massa do TCGA-CRC (DEGs2). A Análise de Rede de Coexpressão Gênica Ponderada (WGCNA) foi aplicada aos dados do TCGA para identificar módulos de genes correlacionados com os escores de DRG.
4. Interseção e Modelagem: O estudo intersectou os DEGs1, DEGs2 e os genes do módulo WGCNA para identificar genes corregulados por CAFs e DRGs. Genes prognósticos foram selecionados por meio de regressão de Cox univariada, seguida de regressão LASSO e modelagem de riscos proporcionais de Cox multivariada para construir uma assinatura de risco.
5. Validação e Caracterização: O modelo de risco foi validado nas coortes TCGA e GSE87211 usando curvas ROC, análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e AUC dependente do tempo. Análises de enriquecimento funcional (GO, KEGG), infiltração imune (CIBERSORT) e sensibilidade a drogas (GDSC) foram conduzidas.
6. Validação Experimental: Uma coorte independente de 20 pacientes com CCR do Hospital Popular de Província de Guizhou foi utilizada para validar os níveis de expressão proteica de genes-chave via imuno-histoquímica (IHC) e imunofluorescência (IF) em tecidos tumorais versus tecidos normais adjacentes.

Principais Resultados

• Interações Celulares: A análise de scRNA-seq revelou que os CAFs e as células endoteliais exibem a interação recíproca mais forte no CCR, mediada principalmente pelos eixos de sinalização GDF15-TGFBR2 e WNT5A-FZD4. Observou-se que os CAFs foram significativamente reduzidos em amostras de CCR em comparação ao tecido normal, enquanto células T e macrófagos foram enriquecidos.
• Interseção de Genes: A partir de 127 DEGs específicos de CAFs, 5.535 DEGs de RNA em massa e 3.627 genes do módulo WGCNA, foram identificados 47 genes de interseção. A análise funcional indicou que esses genes são enriquecidos nas vias de organização da matriz extracelular (ECM) e sinalização Wnt.
• Assinatura Prognóstica: O aprendizado de máquina e a regressão de Cox identificaram dois genes prognósticos fundamentais: SRPX (Proteína contendo repetição Sushi X) e PRELP (Proteína de repetição rica em prolina, arginina e leucina de extremidade C). Um modelo de escore de risco foi construído: Escore de Risco = 0,122 × exp(SRPX) + 0,153 × exp(PRELP).
• Estratificação e Sobrevivência: Pacientes estratificados em grupos de alto e baixo risco com base neste modelo mostraram diferenças significativas de sobrevivência em ambas as coortes TCGA e GSE87211 (P < 0,05). O modelo demonstrou um desempenho preditivo robusto com valores de AUC > 0,6 em 3, 5 e 7 anos.
• Correlação Imunológica: O grupo de alto risco apresentou correlação positiva com a infiltração de macrófagos M0 (r = 0,36 para o escore de risco; r = 0,44 para PRELP) e correlação negativa com células T de memória CD4+ ativadas.
• Trajetória de Diferenciação: A análise de pseudotempo revelou três vias distintas de diferenciação de CAFs. A expressão de SRPX e PRELP foi observada aumentando gradualmente em direção aos estágios de diferenciação terminal (CAF_myo, CAF_AP, CAF_adi), sugerindo que sua regulação positiva está associada à maturação dos CAFs.
• Confirmação Experimental: As análises de IHC e IF confirmaram que SRPX e PRELP estão significativamente regulados positivamente nas áreas tumorais de pacientes com CCR em comparação com os tecidos normais adjacentes, com os níveis mais altos de expressão encontrados nos CAFs primários em comparação com fibroblastos normais e células cancerosas.
• Implicações Terapêuticas: Pacientes de alto risco mostraram maior sensibilidade a quimioterápicos específicos, incluindo Bortezomibe e Docetaxel, na análise de sensibilidade a drogas.

Significância e Alegações
Os autores afirmam que este estudo fornece a primeira caracterização sistemática do crosstalk entre CAFs e disulfidptosis no CCR. Ao integrar dados transcriptômicos de célula única e de massa, o estudo constró de um novo modelo prognóstico baseado em genes derivados de CAFs e relacionados à disulfidptosis (SRPX e PRELP) que estratifica efetivamente o risco de sobrevivência do paciente.

O artigo postula que SRPX e PRELP servem como um elo molecular entre os estados funcionais dos CAFs e a disulfidptosis. Os autores sugerem que a regulação positiva desses genes relacionados à ECM em CAFs terminalmente diferenciados pode contribuir para a remodelação estromal e evasão imune (especificamente ao promover a infiltração de macrófagos M0 e inibir as células T de memória CD4+). Além disso, o estudo propõe que esses genes podem tornar os CAFs ou o microambiente tumoral vulneráveis à disulfidptosis, oferecendo uma nova perspectiva para o direcionamento do compartimento estromal na terapia do CCR. Os achados são apresentados como uma base para compreender a heterogeneidade prognóstica e identificar potenciais alvos terapêuticos, embora os autores reconheçam que os mecanismos moleculares precisos requerem maior elucidação experimental.