NeMO: a flexible R package for nested multi-species occupancy modelling and eDNA study optimization

Het artikel introduceert NeMO, een gebruiksvriendelijk R-pakket dat Bayesiaanse geneste multi-soorten bezettingsmodellen toepast om detectieonzekerheid in eDNA-metabarcoding-studies kwantitatief te analyseren en het ontwerp van dergelijke onderzoeken te optimaliseren.

De kern

Titel: NeMO: De slimme 'eDNA-detector' voor het vinden van verborgen dieren

Stel je voor dat je een meer of een rivier binnenstapt en je wilt weten welke vissen er zwemmen. Normaal gesproken moet je ze vangen, zien of ze horen. Maar wat als de vissen heel schuw zijn, of juist heel klein? Dan zie je ze misschien niet, terwijl ze er wel zijn.

In de moderne ecologie gebruiken wetenschappers een magische techniek genaamd eDNA (milieu-DNA). Dit werkt als een 'geestelijke vingerafdruk'. Vissen laten DNA achter in het water (via slijm, uitwerpselen of huidcellen). Wetenschappers nemen een slok water, filteren het en kijken welke DNA-fragmenten erin zitten. Het is alsof je een bakje water uit de Noordzee haalt en daaruit kunt afleiden of er haaien, dolfijnen of vissen in zwemmen, zonder ze ooit te zien.

Het probleem: De 'Geestelijke' Vissen
Maar er zit een addertje onder het gras. Soms is er DNA in het water, maar vinden we het niet. Waarom?

1. We hebben misschien niet genoeg water gepakt (te weinig steekproeven).
2. In het lab is het DNA misschien niet goed gekopieerd (PCR-fouten).
3. De machine die het DNA telt, heeft niet genoeg 'blikken' op de vissen gericht (te weinig sequencing).

Als we een vis niet vinden, denken we vaak: "Die is er niet." Maar dat is een gevaarlijke fout! De vis is er misschien wel, maar we hebben hem gemist. Dit noemen we een vals-negatief. Voor het behoud van zeldzame of bedreigde soorten is dit een groot probleem.

De Oplossing: NeMO (De Slimme Rekenmachine)
Bastien Macé en zijn team hebben een nieuw computerprogramma gemaakt, genaamd NeMO. Je kunt NeMO zien als een slimme detective of een rekenmachine voor onzekerheid.

In plaats van te zeggen: "We hebben de vis niet gezien, dus hij is weg," zegt NeMO: "Oké, we hebben de vis niet gezien, maar laten we eens kijken hoe waarschijnlijk het is dat we hem gemist hebben."

NeMO doet dit door drie lagen van de zoektocht te analyseren, net als het zoeken naar een schat in een doos:

1. Het veld: Hebben we wel genoeg water gepakt? (De kans dat het DNA in het flesje zit).
2. Het lab: Hebben we het DNA goed gekopieerd? (De kans dat het DNA zichtbaar wordt).
3. De teller: Hebben we genoeg gekeken in de data? (De kans dat we het DNA ook echt zien tellen).

Hoe werkt NeMO in de praktijk?
Stel je voor dat je een grote visserij wilt organiseren. Je wilt weten hoeveel netten (stalen), hoeveel keren je moet herhalen (PCR) en hoe lang je moet tellen (sequencing) om zeker te zijn dat je alle vissen vindt die er zijn.

Vroeger was dit gissen. Met NeMO kun je nu precies berekenen:

• "Voor vissoort A heb je 2 flessen water nodig."
• "Voor vissoort B (die heel schuw is) heb je 20 flessen nodig en 100 herhalingen in het lab!"
• "Voor vissoort C is de sequencing diepte te laag, we moeten de machine langer laten draaien."

De Proef: De Rijn in Frankrijk
De onderzoekers hebben NeMO getest met data uit de Rhône-rivier in Frankrijk. Ze keken naar 100 vissoorten.

• Resultaat 1: Het programma werkte perfect. Het kon onderscheid maken tussen vissen die echt weg waren en vissen die gewoon verborgen zaten.
• Resultaat 2: Het bleek dat sommige vissen heel makkelijk te vinden zijn (zoals de brasem), terwijl andere, zelfs als ze veel voorkomen, heel lastig te detecteren zijn (zoals de modderkruiper).
• Resultaat 3: Ze ontdekten dat voor sommige zeldzame vissen de oorspronkelijke studie niet genoeg moeite had gedaan. Als je die vissen echt wilt vinden, moet je veel meer werk verzetten (meer water, meer labwerk).

Waarom is dit belangrijk?
NeMO helpt wetenschappers en beleidsmakers om slimmer te plannen.

• Besparen: Je hoeft niet overal evenveel te meten. Je kunt je geld en tijd steken waar het nodig is.
• Betrouwbare conclusies: Je kunt niet meer zomaar zeggen "er is geen bedreigde vis meer". Je kunt nu zeggen: "We hebben gezocht tot aan de uiterste limiet, en toen was hij er echt niet."
• Optimalisatie: Het helpt bij het ontwerpen van toekomstige onderzoeken. "Hoeveel flessen water moeten we nemen om 95% zekerheid te hebben?"

Kortom:
NeMO is een krachtig, gebruiksvriendelijk hulpmiddel dat de 'blindheid' van eDNA-onderzoek wegneemt. Het vertaalt ruwe data naar betrouwbare antwoorden, zodat we de biodiversiteit in onze rivieren en meren beter kunnen beschermen, zelfs als de bewoners zich goed verstoppen. Het is de sleutel om van 'misschien' naar 'weten' te gaan.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Het monitoren van biodiversiteit met behulp van metabarcoding van omgevings-DNA (eDNA) heeft zich snel ontwikkeld tot een krachtig, niet-invasief instrument. Een kritieke beperking van deze methode is echter de onvolmaakte detectie: eDNA-survey's zijn vatbaar voor "false negatives" (een soort is aanwezig maar wordt niet gedetecteerd). In veel studies worden niet-detecties ten onrechte geïnterpreteerd als ware afwezigheid, wat leidt tot onderschatting van invasieve soorten, ontoereikende conservatie-inspanningen en vertekende beoordelingen van gemeenschapssamenstelling.

Hoewel bezettingsmodellen (occupancy modeling) een statistisch raamwerk bieden om deze detectie-onzekerheid te kwantificeren, worden ze onderbenut in eDNA-studies, vooral bij multi-soort metabarcoding. Bestaande tools missen vaak flexibiliteit om de complexe, geneste structuur van eDNA-werkstromen (veldmonsters, PCR-replicaten, sequencing) volledig te modelleren, of ze ondersteunen geen modelvergelijking en optimalisatie van steekproefinspanningen.

Methodologie

De auteurs hebben NeMO (Nested eDNA Metabarcoding Occupancy) ontwikkeld, een gebruiksvriendelijk R-pakket dat Bayesiaanse multi-soort bezettingsmodellen implementeert.

1. Het Geneste Model:
Het model houdt rekening met de hiërarchische structuur van eDNA-studies, bestaande uit drie niveaus:

• Site-niveau: De bezettingswaarschijnlijkheid ($\psi$) dat eDNA van een soort aanwezig is op een locatie.
• Monster-niveau: De kans ($\theta$) dat eDNA wordt verzameld in een veldmonster, gegeven dat het aanwezig is.
• PCR-replicaat-niveau: De kans ($p$) dat eDNA wordt geamplificeerd in een PCR-replicaat, gegeven dat het is verzameld.
• Sequencing-niveau: De verwachte read-counts ($\varphi$), gemodelleerd via een multinomiale verdeling (voor read-counts) en een negatieve binomiale verdeling (voor latent read-counts), rekening houdend met de totale sequencing-diepte.

2. Flexibiliteit en Covariaten:
NeMO ondersteunt verschillende datastructuren en experimentele ontwerpen:

• Data-typen: Het kan werken met zowel aanwezig/afwezig-data als kwantitatieve read-counts.
• Replicatie: Het ondersteunt zowel individueel geïndexeerde PCR-replicaten als samengevoegde (gepoolde) replicaten.
• Covariaten: Gebruikers kunnen omgevings- en methodologische covariaten opnemen op elk niveau van de hiërarchie om te onderzoeken hoe deze factoren bezetting en detectie beïnvloeden.
• Bayesiaans Raamwerk: Het model wordt geschat met Markov Chain Monte Carlo (MCMC) sampling via JAGS, waarbij parameters als willekeurige effecten worden behandeld om "borrowing of strength" over de gemeenschap mogelijk te maken.

3. Hulpmiddelen voor Optimalisatie:
Naast het schatten van parameters biedt NeMO functies voor:

• Modelvergelijking: Berekening van de WAIC (Watanabe-Akaike Information Criterion) om modellen te vergelijken.
• Resource-optimalisatie: De functie min_resources() berekent het minimale aantal monsters, PCR-replicaten en sequencing-diepte dat nodig is om een soort met een specifieke waarschijnlijkheid (bijv. 95%) te detecteren, mits deze aanwezig is.

Belangrijkste Bijdragen

• Integratie van complexiteit: NeMO is de eerste tool die de volledige geneste structuur van eDNA (site -> monster -> PCR -> sequencing) combineert met multi-soort modellering en read-count data in één flexibel raamwerk.
• Optimalisatie van studieontwerp: Het pakket verschuift de focus van alleen het schatten van bezetting naar het daadwerkelijk optimaliseren van de steekproefinspanning, wat cruciaal is voor kosteneffectief monitoren.
• Toegankelijkheid: Het maakt geavanceerde Bayesiaanse modellering toegankelijk voor een breder publiek van ecologen en stakeholders door een gebruiksvriendelijke R-interface te bieden.

Resultaten

Het pakket werd getest op een empirisch dataset van vissoorten in de Rhône-rivier (Frankrijk), bestaande uit 80 locaties, 2 monsters per locatie en 12 PCR-replicaten per monster (100 soorten).

• Modelprestaties: Drie verschillende modelleringprotocollen ('PCR_rep_seq_read', 'seq_read', 'PCR_rep') leverden vergelijkbare resultaten op qua nauwkeurigheid (AUC ~0,8), maar de uitvoeringstijd verschilde aanzienlijk. Het meest complexe protocol ('PCR_rep_seq_read') was het traagst, maar bood de meest gedetailleerde informatie.
• Correlaties: Er was een sterke positieve correlatie tussen de detectieparameters (verzameling, amplificatie, read-counts). Soorten met hoge bezetting hadden over het algemeen ook hogere detectiekansen.
• Rariteit vs. Ontwijkendheid: Het model onderscheidde duidelijk tussen soorten die zeldzaam zijn (lage bezetting, $\psi$) en soorten die moeilijk te detecteren zijn (lage detectiekans, $\theta, p, \varphi$). Bijvoorbeeld, Alosa spp. was zeldzaam maar goed detecteerbaar, terwijl Scardinius erythrophthalmus veel voorkwam maar moeilijk te detecteren was.
• Optimalisatie: De analyse toonde aan dat het oorspronkelijke steekproefontwerp (2 monsters, 12 PCR's) voldoende was voor 63% van de soorten. Voor andere soorten, zoals Leucaspius delineatus, zou het bereiken van een 95% detectiekans echter onpraktisch hoge aantallen PCR-replicaten vereisen, wat wijst op fundamentele beperkingen van het huidige ontwerp voor deze specifieke doelen.
• Sequencing-diepte: De sequencing-diepte was over het algemeen voldoende; het gebrek aan detectie was meestal te wijten aan onvoldoende PCR-replicatie of monstername, niet aan sequencing-capaciteit.

Betekenis en Conclusie

NeMO biedt een essentiële stap voorwaarts in de validiteit van eDNA-studies. Door detectie-onzekerheid expliciet te modelleren, voorkomt het dat onderzoekers ten onrechte concluderen dat soorten afwezig zijn. Het pakket stelt onderzoekers in staat om:

1. Betrouwbare bezettingschatten te maken die rekening houden met valse negatieven.
2. Studieontwerpen te optimaliseren voordat er geld wordt uitgegeven, door te bepalen hoeveel monsters en replicaten nodig zijn voor betrouwbare detectie.
3. Methodologische beperkingen te identificeren (bijv. wanneer een soort zo ontwijkend is dat eDNA met het huidige protocol niet werkt).

De auteurs benadrukken dat het kwantificeren van detectie-onzekerheid cruciaal is voor effectief biodiversiteitsmonitoring en het ontwikkelen van kosteneffectieve strategieën voor het behoud van bedreigde en ontwijkende soorten.