Trypanosoma cruzi genetic diversity associates with serological diagnostic assay performance

Technische Samenvatting: Genetische diversiteit van Trypanosoma cruzi correleert met de prestaties van serologische diagnostische assays

Probleemstelling
De diagnose van de ziekte van Chagas, veroorzaakt door de protozoaire parasiet Trypanosoma cruzi, is primair afhankelijk van serologische assays. Het ontbreken van een gouden standaardtest vereist echter een complex algoritme dat twee verschillende assays vereist, waarbij een derde nodig is bij tegenstrijdige resultaten. Serodiscordantie — waarbij monsters conflicterende resultaten opleveren over verschillende serologische tests — wordt steeds vaker gerapporteerd, met name in Centraal- en Noord-Amerika. Dit fenomeen leidt tot onderdiagnose en het verwerpen van werkelijke infecties als fout-positieve resultaten. Hoewel eerdere hypothesen suggereerden dat lage antilichaamniveaus na genezing of gastheerfactoren de oorzaak van discordantie waren, gaf eerder werk aan dat de parasitaire belasting identiek is tussen serodiscordante en bevestigd positieve monsters. Bijgevolg hypotheseerden de auteurs dat de genetische diversiteit van de infecterende parasietstammen, specifelijk de samenstelling van de "cruziome" (de verzameling van parasietstammen die een gastheer infecteren), de humorale respons en daarmee de prestaties van diagnostische assays zou kunnen beïnvloeden.

Methodologie
De studie maakte gebruik van gearchiveerde moederlijke bloedmonsters uit een cohort van 503 zwangere vrouwen uit Argentinië, Honduras en Mexico. De monsters werden gestratificeerd in "bevestigd positief" (reactief in twee snelle tests en een bevestigende ELISA) en "serodiscordant" (negatieve ELISA met nul tot twee reactieve snelle tests).

• Genotypering: De onderzoekers voerden hoog-resolutie genotypering uit op een subset van 73 succesvol gegenotypeerde monsters met behulp van Next-Generation Sequencing (Illumina MiSeq van het mini-exon gen). Deze aanpak maakte de reconstructie van haplotypes en de schatting van hun relatieve abundantie binnen elke gastheer mogelijk.
• Cruziome-analyse: De studie analyseerde de "cruziome" op meerdere niveaus:
  1. Complexiteit/Grootte: Het vergelijken van het aantal Discrete Typing Units (DTU's) en het aantal sequentie-haplotypes per individu tussen de serologische groepen.
  2. Samenstelling: Het beoordelen van de aanwezigheid/afwezigheid en de relatieve proporties van specifieke DTU's (TcI–TcVI).
  3. Fylogenetische Structuur: Het uitvoeren van fylogenetische analyse van mini-exon sequenties binnen specifieke DTU's om clustering op basis van geografische oorsprong (land) en serologische uitkomst te identificeren.
• Statistische Analyse: De auteurs maakten gebruik van Student's t-tests, Chi-kwadraattesten, PERMANOVA (voor bèta-diversiteit) en Lineaire Discriminant Analyse (LDA). Cruciaal was dat zij Single Nucleotide Polymorphisms (SNP's) identificeerden binnen de mini-exon sequenties van de TcI, TcII en TcV DTU's. Zij testten de associatie van deze SNP's met serologische uitkomsten met behulp van Chi-kwadraattesten en odds ratio's, waarbij de Bonferroni-correctie werd toegepast voor meervoudige testen. Ten slotte werden multivariate logistische regressiemodellen geconstrueerd om diagnostische uitkomsten te voorspellen op basis van SNP-combinaties.

Belangrijkste Resultaten

• Cruziome Complexiteit: De studie bevestigde dat het overgrote deel (98,6%) van de infecties meerdere DTU's omvatte. Echter, noch het aantal DTU's, noch het aantal haplotypes per individu verschilde significant tussen bevestigd positieve en serodiscordante monsters.
• DTU Samenstelling: Er was geen significant verschil in de algehele samenstelling of de aanwezigheid/afwezigheid van specifieke DTU's (TcI, TcII, TcIV, TcV, TcVI) tussen de twee serologische groepen.
• Genetische Clustering: Fylogenetische analyse onthulde significante geografische structurering van sequenties binnen de TcI, TcII, TcV en TcVI DTU's. Belangrijker nog, sequenties van serodiscordante monsters vertoonden significante fylogenetische clustering die afweek van bevestigd positieve monsters binnen de TcI, TcII en TcV DTU's.
• SNP Associatie: De auteurs identificeerden specifieke SNP's binnen de TcI, TcII en TcV mini-exon sequenties die significant geassocieerd waren met serodiscordantie. Verschillende van deze associaties bleven statistisch significant na Bonferroni-correctie. De frequentie van deze SNP's weerspiegelde de geografische distributie van serodiscordantie (het hoogst in Mexico, intermediair in Honduras, het laagst in Argentinië).
• Voorspellend Model: Een multivariant logistisch regressiemodel gebruikmakend van een kleine set SNP's van de TcI, TcII en TcV slaagde erin diagnostische uitkomsten te voorspellen met een nauwkeurigheid van 80,3%. Bovendien bleken SNP-combinaties belangrijke factoren te zijn die de uitkomsten van individuele assays (Stat-Pak, T-detect en Wiener ELISA) aanstuurden, waarbij ze 75–88% van de diagnostische variantie verklaarden.

Betekenis en Claims
Het artikel claimt dat de genetische diversiteit van T. cruzi stammen, specifelijk binnen de TcI, TcII en TcV DTU's, een primaire drijfveer is van serologische discordantie. De auteurs stellen dat de samenstelling van de "cruziome", in plaats van alleen de aanwezigheid van een specifieke DTU, de humorale respons beïnvloedt. Zij stellen voor dat infecties met bepaalde genetisch onderscheidende stammen antilichamen opwekken die gericht zijn op epitopen die niet worden gedekt door de huidige diagnostische antigenen (die grotendeels afkomstig zijn van Southern Cone-stammen), wat leidt tot falende of discordante assays.

De studie concludeert dat de geografische distributie van T. cruzi DTU's complexer is dan voorheen gedacht, met aanzienlijke lokale genetische differentiatie zelfs binnen DTU's. De auteurs beweren dat het rekening houden met deze lokale diversiteit cruciaal is voor de ontwikkeling van verbeterde diagnostische instrumenten met optimale prestaties over de Amerika's heen. De bevindingen versterken het concept van de cruziome als een relevante factor in de interactie tussen gastheer en parasiet, wat invloed heeft op diagnose, pathogenese en potentieel ook op behandelingsrespons.