Sub-100 ns transition paths in unmodified single protein measurements

Eiwitten zijn de werkpaarden van het leven, kleine moleculaire machines die zichzelf in precieze vormen vouwen om taken uit te voeren die variëren van het vervoeren van zuurstof in het bloed tot het kopiëren van genetische instructies. Voor deze machines is het essentieel dat ze een specifieke structuur behouden, maar ze zijn geen statische standbeelden; ze verschuiven voortdurend, ademen en veranderen soms zelfs volledig van vorm. Wetenschappers weten al lang dat deze veranderingen kunnen plaatsvinden over een enorm tijdsbereik. Sommige verschuivingen zijn traag en duren seconden of zelfs minuten, terwijl andere zo snel zijn dat ze met de huidige technologie als bijna onmogelijk te vangen werden beschouwd. De uitdaging was het bouwen van een instrument waarmee men een enkel eiwitmolecuul kan observeren zonder het aan te raken, zonder er een fluorescente tag aan te plakken die de beweging zou kunnen veranderen, en zonder de fractie van een seconde te missen waarin het van vorm springt. Als onderzoekers deze razendsnelle overgangen zouden kunnen zien, zouden ze eindelijk de ultrasnelle bewegingen die door computermodellen worden voorspeld, kunnen verbinden met de tragere, biologisch relevante veranderingen die in de echte wereld worden waargenomen.

Een team van onderzoekers heeft nu een methode ontwikkeld die in staat is om deze gebeurtenissen in realtime te observeren, waarbij eiwitbewegingen die minder dan honderd nanoseconden duren, worden vastgelegd. Met behulp van een techniek genaamd temperatuur-sprong nanoapertuur optische pincetten, trapten ze enkele, ongewijzigde eiwitmoleculen in een minuscuul gaatje in een metalen film en verhitten ze met een laser om veranderingen te triggeren. Deze opstelling stelde hen in staat om de gehele levensloop van een eiwitbeweging te observeren, van de trage pauzes tussen veranderingen die minuten duren, tot de vluchtige overgangen die een fractie van een microseconde duren. De studie richtte zich op twee specifieke eiwitten: boveense serumalbumine, dat in koeienbloed wordt gevonden, en conalbumine, een eiwit dat in eieren wordt gevonden. Door deze moleculen stap voor stap te verhitten, observeerde het team hoe ze ontvouwden, hervouwden en dramatische structurele verschuivingen ondergingen, waardoor een verborgen wereld van snelheid werd onthuld die voorheen onzichtbaar was voor directe observatie.

Wanneer de onderzoekers deze methode toepasten op boveense serumalbumine, getuigden zij van een verbijsterend snelle gebeurtenis. Terwijl de temperatuur steeg naar een specifiek bereik, onderging het eiwit een plotselinge, onomkeerbare transformatie. Het signaal van het gevangen molecuul vertoonde een scherpe stapverandering die slechts 44 nanoseconden duurde, en gemiddeld vonden deze snelle overgangen plaats in minder dan 100 nanoseconden. Om deze snelheid in perspectief te plaatsen: het is een orde van grootte sneller dan de voorheen bekende "snelheidslimiet" voor hoe snel een eiwit kan vouwen. Het team bevestigde dat deze snelle verandering een verschuiving was van een gekrulde, spiraalvormige structuur bekend als een alfa-helix naar een platte, plaatvormige structuur genaamd een bèta-plaat. Dit specifieke type verandering is significant omdat het gelinkt is aan ernstige biologische problemen, zoals de vorming van klonters bij neurodegeneratieve ziekten, maar het is ook essentieel voor normale processen zoals bloedstolling. De onderzoekers verifieerden dat dit een echte structurele verschuiving was en niet slechts een willekeurige fluctuatie door een chemische stof genaamd ureum toe te voegen, die bekend staat om het ontvouwen van eiwitten. Bij de aanwezigheid van ureum verdween de snelle, scherpe transitie en werd deze vervangen door een veel trager, chaotisch ontvouwingsproces, wat bewees dat de oorspronkelijke snelle gebeurtenis een specifieke, georganiseerde verandering in de vorm van het eiwit was.

In tegen tegenstelling tot de eenrichtingsweg die werd waargenomen bij boveense serumalbumine, zagen het team conalbumine een reversibele dans van ontvouwen en hervouwen uitvoeren. Wanneer het werd verhit, ontvouwde dit eiwit in ongeveer 1,8 milliseconden, een snelheid die nog steeds ongelooflijk snel is maar meetbaar met standaardapparatuur. Eenmaal ontvouwd, sprong het molecuul niet onmiddellijk terug; het bleef lang in zijn open, ongeordende staat, met een mediane wachttijd van 68 seconden voordat het besloot weer te vouwen. Wanneer het eindelijk weer ging vouwen, duurde het proces 17 milliseconden. Dit vermogen om een enkel molecuul meer dan een minuut te laten pauzeren en daarna weer in vorm te laten springen, bood een compleet beeld van het energielandschap van het eiwit, waarbij zowel de diepe dalen waar het rust als de steile heuvels die het moet oversteken om van vorm te veranderen, zichtbaar werden. De onderzoekers testten ook ribonuclease A, een ander eiwit dat bekend staat om zijn vermogen om te hervouwen, en observeerden een tragere transitie van drie seconden, wat consistent is met wat wordt gezien bij grotere groepen moleculen.

De kracht van deze nieuwe benadering ligt in het vermogen om de kloof te overbruggen tussen twee verschillende werelden van de wetenschap. Jarenlang hebben computersimulaties voorspeld dat eiwitten deze ultrasnelle overgangen kunnen maken in minder dan 100 nanoseconden, maar experimentele instrumenten waren te traag om ze te zien en filterden de snelste signalen vaak weg als ruis. Tegelijkertijd konden andere experimenten alleen het trage, gemiddelde gedrag van miljoens moleculen tegelijk zien, waarbij het unieke verhaal van elk individueel molecuul verloren ging. Deze nieuwe methode legt het volledige bereik van beweging vast, van de nanoseconde-flikkering van een structurele omslag tot het urenlange wachten van een eiwit in een stabiele staat, en dat alles zonder het eiwit te veranderen met labels of verbindingen. Door te bewijzen dat deze sub-100 nanoseconde overgangen echt en meetbaar zijn, biedt dit werk een solide fundament voor het verfijnen van computermodellen en het begrijpen van hoe eiwitten hun complexe energielandschappen navigeren. De bevindingen suggereren dat de snelle, georganiseerde verschuivingen tussen verschillende vormen niet alleen theoretische mogelijkheden zijn, maar fundamentele onderdelen van hoe eiwitten functioneren en soms defect raken in het lichaam.