Characterization and Validation of a Novel Patent-Pending Autologous Exosome Purification Kit from Human Peripheral Blood: Morphological and Immunophenotypic Evidence

Binnen het menselijk lichaam vindt een constante, stille conversatie plaats tussen cellen. Ze spreken niet met woorden, maar met kleine, door membranen omhulde pakketjes die door het bloed zweven en boodschappen van het ene deel van het lichaam naar het andere dragen. Wetenschappers noemen deze pakketjes extracellulaire blaasjes, en de kleinste, meest bestudeerde onder hen staan bekend als exosomen. Dit zijn microscopische sferen, variërend van dertig tot honderdvijftig nanometer in diameter, die worden uitgescheiden door bijna elk type cel. Ze zijn gevuld met eiwitten, vetten en genetische instructies die de gezondheid en de status van de cel die ze heeft gemaakt, weerspiegelen. Omdat ze zo vrij reizen, hebben artsen en onderzoekers lang gehoopt hen te kunnen gebruiken als vensters naar de innerlijke werking van het lichaam, met het potentieel om ziekten vroegtijdig te diagnosticeren of helende signalen af te leveren aan beschadigde weefsels zonder de bijwerkingen van traditionele medicijnen.

Het vangen van deze kleine boodschappers uit een monster van menselijk bloed is echter een frustrerende puzzel gebleken. Het bloed is een dikke, complexe soep die cellen, eiwitten en vetten bevat die vaak veel groter of plakkeriger zijn dan de vesikels zelf. Jarenlang omvatte de standaardmethode om deze vesikels te scheiden het centrifugeren van bloedmonsters op extreem hoge snelheden in een machine die een ultracentrifuge wordt genoemd. Deze methode is hardvochtig; de intense kracht kan de delicate vesikels verpletteren, ze aan elkaar laten klonteren, of een mengsel achterlaten dat vervuild is met andere bloedcomponenten die de resultaten verwarren. Andere methoden bestaan, maar die verdunnen het monster vaak of vereisen dure, gespecialiseerde apparatuur die moeilijk te gebruiken is in een ziekenhuissetting. Het vakgebied wachtte op een zachtere, schonere manier om deze deeltjes te isoleren, een manier die hun vorm en zuiverheid behoudt terwijl het eenvoudig genoeg is voor routinematig medisch gebruik.

Een team van onderzoekers van Biotex Life Solutions in India heeft nu een nieuw hulpmiddel getest dat ontworft is om dit probleem op te lossen. Ze hebben een kit ontwikkeld die beweert deze kleine vesikels uit menselijk bloed te trekken in één enkele, eenvoudige stap, zonder de noodzaak van hoogsnelheidscentrifugeren of complexe chemische kolommen. Het proces begint met een eenvoudige bloedafname van een gezonde vrijwilliger. Het bloed wordt in een speciale buis geplaatst met een unieke gel onderin. Deze gel is geen statische barrière; het is een slim materiaal dat van dikte verandert wanneer het wordt gesponnen. Voordat het centrifugeren begint, wordt het bloed licht verwarmd om de cellen aan te moedigen meer van hun vesikelpakketjes vrij te geven. Vervolgens wordt de buis in een standaard laboratoriumcentrifuge geplaatst, die tien minuten lang op een milde snelheid draait. Terwijl de buis draait, verandert de gel in een vloeibare barrière die de zware bloedcellen tegenhoudt om te mengen met het lichtere plasma, wat een schone scheiding creëert. De vloeibare laag die de vesikels bevat, wordt vervolgens opgezogen en door een speciaal injectiespuitfilter met twee membraanlagen geleid. Dit filter werkt als een zeer fijne zeef, die alles opvangt dat groter is dan de doelvesikels, terwijl de sferen van dertig tot honderdvijftig nanometer in diameter erdoorheen passeren in een schoon opvangbuisje.

De onderzoekers wilden weten of deze methode daadwerkelijk werkte en of de deeltjes die ze opvingen de echte waren. Om dit te achterhalen, namen ze de gezuiverde vloeistof van drie verschillende vrijwilligers en bekeken deze onder twee krachtige soorten microscopen. Eerst gebruikten ze een transmissie-elektronenmicroscoop, die elektronen door een monster schiet om een beeld met ongelooflijk detail te creëren. De beelden onthulden precies wat ze hoopten te zien: duizenden kleine, ronde deeltjes die in de vloeistof zweven. Deze deeltjes hadden de karakteristieke komvormige structuur die wetenschappers associëren met exosomen, en ze waren allemaal binnen de juiste grootteklasse. Cruciaal was dat de beelden lieten zien dat de deeltjes intacte buitenwanden hadden en niet verpletterd of geklonterd waren, wat suggereert dat het zachte proces hun structuur had behouden. De onderzoekers merkten ook op dat de vloeistof opmerkelijk vrij was van de grote eiwitklonters en cellulaire resten die meestal monsters vervuilen die met oudere, hardere methoden zijn voorbereid.

Om te bevestigen dat deze deeltjes inderdaad het specifieke type vesikels waren waar ze naar op zoek waren, gebruikte het team een tweede methode genaamd flowcytometrie. Deze techniek schijnt lasers op de deeltjes terwijl ze voorbijstromen, waarbij specifieke markers op hun oppervlak worden gedetecteerd. De onderzoekers testten op CD9 en CD63, eiwitten die bekend staan om hun aanwezigheid op het oppervlak van exosomen, en CD45, een marker die aanwezig is op witte bloedcellen die zij wilden uitsluiten. In de onbehandelde bloedmonsters vóór de zuivering was de mix van deeltjes rommelig, met een aanzienlijke hoeveelheid ongewenste markers van witte bloedcellen aanwezig. Maar nadat de kit de monsters had verwerkt, veranderden de resultaten drastisch. De gezuiverde monsters vertoonden een zeer hoog percentage deeltjes met de CD9- en CD63-markers, terwijl de ongewenste markers van witte bloedcellen grotendeels waren verwijderd. In één monster steeg het percentage deeltjes met de CD9-marker van een lage baseline naar meer dan tachtig drie procent na de zuivering. In een ander sample steeg de CD63-marker naar bijna negentig procent. De controles, die helemaal geen bloed bevatten, vertoonden nul markers, wat bewees dat de signalen afkomstig waren van de bloedmonsters en niet van de apparatuur of de kit zelf.

De studie concludeert dat deze nieuwe kit erin slaagt om kleine extracellulaire vesikels uit menselijk bloed te isoleren met een hoge mate van zuiverheid en snelheid. Het gehele proces, van de bloedafname tot het verzamelen van de uiteindelijke gezuiverde vloeistof, duurt minder dan vijfenveertig minuten en vereist slechts een standaard centrifuge die in de meeste medische laboratoria te vinden is. De onderzoekers stelden vast dat de methode consistent vesikels produceerde die er onder de microscoop juist uitzagen en de juiste oppervlaktemarkers droegen, ongeacht welke vrijwilliger het bloed had geleverd. Hoewel de studie nog niet bewijst dat deze vesikels ziekten kunnen genezen of condities bij patiënten kunnen diagnosticeren, demonstreert het dat het hulpmiddel betrouwbaar een schone, geconcentreerde voorraad van deze biologische boodschappers kan produceren. Dit vertegenwoordigt een belangrijke stap voorwaarts, biedt een praktisch alternatief voor de complexe en schadelijke methoden die momenteel in gebruik zijn, en opent de deur voor het gemakkelijker te gebruiken van deze vesikels in zowel onderzoek als potentiële toekomstige therapieën.