TransPrimer: A Web-Based Tool for Automated Transcript-Specific RT-PCR/qPCR Primer Design Across Multiple Species

In elke levende cel fungeren genen als blauwdrukken, maar de instructies die ze bevatten worden zelden exact zo gelezen als ze zijn opgeschreven. Voordat de boodschap van een gen wordt gebruikt om een eiwit te bouwen, bewerkt de cel de ruwe tekst vaak door bepaalde secties eruit te knippen en de overgebleven stukjes in verschillende volgordes aan elkaar te naaien. Dit proces, bekend als alternatieve splicing, stelt een enkel gen in staat om meerdere verschillende versies van een molecuul genaamd RNA te produceren. Deze verschillende versies, of transcripten, kunnen op papier bijna identiek lijken en delen de meeste van hun interne sequenties, maar ze verschillen in de manier waarop hun secties aan elkaar zijn verbonden. Voor wetenschappers die deze moleculen proberen te bestuderen, vormt deze gelijkenis een aanzienlijke hindernis. Om een specifieke versie van een RNA te meten, moeten onderzoekers moleculaire instrumenten ontwerpen die die exacte versie kunnen vinden en eraan kunnen binden zonder per ongeluk zijn bijna identieke broertjes of zusjes te grijpen. Als het instrument aan de verkeerde versie bindt, wordt de resulterende data een verwarrende mix die het ware biologische beeld vertroebelt.

Een team van onderzoekers aan de Johns Hopkins University en Vugle Health heeft een nieuwe digitale tool ontwikkeld genaamd TransPrimer om dit specifieke probleem op te lossen. De tool is een webgebaseerde applicatie die is ontworpen om automatisch de precieze moleculaire sleutels te maken die nodig zijn om individuele RNA-transcripten te targeten, zelfs wanneer ze deel uitmaken van een complex familie van nauw verwante varianten. In plaats van dat wetenschappers handmatig door duizenden genetische sequenties moeten ploeteren om een unieke plek te vinden, doet TransPrimer het zware werk. Het haalt de bekende genetische blauwdrukken voor een specifiek gen op uit een centrale database, vergelijkt de verschillende versies zij aan zij en identificeert de exacte locaties waar ze van elkaar verschillen. Deze verschillen kunnen een uniek stuk sequentie zijn dat alleen in één transcript voorkomt, of ze kunnen een specifieke junctie zijn waar twee secties van RNA op een manier aan elkaar worden gevoegd die uniek is voor die versie.

De software werkt door eerst de structuur van het betreffende gen te begrijpen. Het roept alle bekende variaties voor dat gen op over zes verschillende soorten, waaronder mensen, muizen, fruitvliegjes en gist. Vervolgens brengt het de verbindingen tussen de secties van het RNA in kaart. Als een wetenschapper slechts één specifieke versie wil bestuderen, scant de tool de familie om een regio te vinden die uniek is voor dat doelwit. Als er geen enkele unieke regio bestaat, zoekt de tool naar een junctie waar twee secties samenkomen. De tool kan zelfs een instrument ontwerpen dat twee verschillende juncties tegelijkertijd overspant als één enkele junctie niet voldoende is om de versies van elkaar te onderscheiden. Dit vermogen om verschillende strategieën te combineren, stelt het systeem in staat om oplossingen te vinden waar eenvoudigere methoden zouden falen. De tool biedt ook een reverse modus voor wetenschappers die de gehele familie van RNA-versies tegelijkertijd willen bestuderen. In deze modus zoekt het naar een gemeenschappelijke regio die door alle varianten wordt gedeeld, waardoor een enkele experiment de totale hoeveelheid van de activiteit van een gen kan vastleggen, ongeacht welke specifieke versie aanwezig is.

Zodra een potentieel doelwit is geïdentificeerd, stopt de tool niet bij het louter vinden van de sequentie. Het berekent de fysieke eigenschappen van het moleculaire instrument om te garanderen dat het in een echte laboratoriumsetting zal werken. Het controleert hoe sterk het instrument aan het doelwit zal binden onder specifieke omstandigheden, zoals de temperatuur en de chemische omgeving van de reactie. Deze berekening is bijzonder zorgvuldig bij het omgaan met junctie-overspannende instrumenten. Het evalueert de stabiliteit van de verbinding van het instrument met elke kant van de junctie afzonderlijk, om er zeker van te zijn dat het instrument stabiel genoeg blijft om te werken en tegelijkertijd specifiek genoeg is om de verkeerde versies te negeren. Het systeem koppelt dit primaire instrument vervolgens aan een bijbehorende partner om een volledige set klaar voor gebruik te creëren. Gedurende dit hele proces biedt de software een visuele kaart van het gen, waarbij precies wordt benadrukt waar de verschillen liggen en wordt getoond aan de gebruiker waarom een bepaald ontwerp is gekozen.

De onderzoekers hebben dit nieuwe systeem getest tegen bestaande methoden met behulp van een reeks real-world voorbeelden die menselijke genen betreffen. In een vergelijking die dertig vijf verschillende gevallen omvatte, genereerde TransPrimer succesvol een werkend ontwerp voor negenentwintig van hen. In contrast hiermee slaagde een veelgebruikte alternatieve tool er in slechts zeventien van dezelfde gevallen in om een ontwerp te vinden onder dezelfde omstandigheden. Het succes van het nieuwe systeem kwam vaak voort uit zijn vermogen om complexere strategieën te gebruiken, zoals het tegelijkertijd targeten van twee juncties, wat andere tools niet probeerden. Voor de weinige gevallen waarin geen ontwerp mogelijk was, identificeerde het systeem correct dat de genetische verschillen te klein waren om de versies te onderscheiden, in plaats van een gebrekkige oplossing af te dwingen. De tool bevat ook een functie voor wetenschappers die werken met nieuwe of niet-geregistreerde genetische sequenties. Gebruikers kunnen een sequentie die zij in hun eigen experimenten hebben ontdekt in de software plakken, en de software zal deze uitlijnen met bekende gegevens of vergelijken met andere door de gebruiker verstrekte sequenties om een ontwerpstrategie te vinden, zelfs zonder een vooraf bestaande label in de hoofddatabase.

Dit werk vertegenwoordigt een verschuiving van handmatige inspectie naar geautomatiseerde besluitvorming in genetisch onderzoek. Door de stappen van het vinden van verschillen, het kiezen van een strategie en het controleren van de fysieke stabiliteit van de instrumenten te integreren in één enkele workflow, vermindert TransPrimer de tijd en expertise die nodig zijn om deze experimenten te ontwerpen. Het handelt zowel de algemene eiwitcoderende genen als de minder bestudeerde niet-coderende RNA's af, en het werkt over een breed scala aan soorten. Hoewel de tool de noodzaak niet wegneemt voor wetenschappers om hun resultaten in het lab te verifiëren, biedt het een zeer betrouwbaar startpunt dat rekening houdt met de complexe manieren waarop genen worden bewerkt en verbonden. Het systeem is gratis online beschikbaar, waardoor onderzoekers hun gen van interesse kunnen invoeren en een op maat gemaakt ontwerpplan kunnen ontvangen dat met precisie door het ingewikkelde landschap van genetische variatie navigeert.