Real-World Single-Center Study of Primary Immunodeficiency in Chinese Children: Diagnostic Efficacy and Genomic Landscape Revealed by Whole-Exome Sequencing Combined with Copy Number Variant Analysis

Technische Samenvatting: Real-world Single-Center Studie naar Primaire Immunodeficiëntie bij Chinese Kinderen

Probleemstelling
Inborn Errors of Immunity (IEI), voorheen bekend als Primary Immunodeficiency Diseases (PID), vormen een genetisch heterogene groep van meer dan 508 stoornissen. Ondanks dat zij naar schatting 1% van de wereldbevolking treffen, blijft IEI ernstig ondergediagnosticeerd, met name in omgevingen met beperkte middelen zoals China, waar het aandeel klinisch herkende gevallen slechts circa 5% van de geschatte last is. De diagnostische kloof wordt verergerd door hoge fenotypische heterogeniteit, aspecifieke klinische presentaties en beperkte toegang tot gespecialiseerde tests. Als gevolg hiervan worden patiënten geconfronteerd met vertraagde diagnoses, recidiverende levensbedreigende infecties en aanzienlijke financiële druk. Hoewel Whole-Exome Sequencing (WES) een transformerend diagnostisch instrument is geworden, blijft de real-world prestatie, de optimale selectiecriteria voor patiënten en de klinische bruikbaarheid in diverse Aziatische pediatrische populaties — specifiek met betrekking tot de integratie van Copy Number Variant (CNV) analyse en trio-sequencing — onvoldoende gekarakteriseerd.

Methodologie
Deze retrospectieve, single-center studie werd uitgevoerd in het Guangxi Maternal and Child Health Hospital (Nanning, China) tussen januari 2020 en september 2025. De cohort bestond uit 243 pediatrische patiënten (leeftijd 10 dagen tot 15 jaar) die klinisch verdacht werden van IEI op basis van gevestigde "red flag"-criteria, waaronder recidiverende/ernstige infecties, atypische infectiepatronen, multisysteem betrokkenheid, of laboratoriumbewijs van immuundysregulatie.

• Sequencing en Bio-informatica: Alle deelnemers ondergingen WES met behulp van de Agilent SureSelect Clinical Research Exome V2 Kit op een Illumina HiSeq 2500 platform (gemiddelde diepte ~255×). De raw reads werden uitgelijnd met GRCh37/hg19.
• CNV Detectie: Een methode gebaseerd op de dekking van de leesdiepte werd toegepast om CNV's direct uit WES-data te detecteren. Genormaliseerde leesdieptes werden per exon berekend, en kandidaat-CNV's werden geïdentificeerd als genomische segmenten die ten minste drie opeenvolgende exonen beslaan met een genormaliseerde dekking die significant afwijkt van de batch-specifieke baseline (|Z-score| > 3).
• Variant Classificatie: Kandidaat-varianten werden gescreend met het TGex-platform en geclassificeerd volgens de ACMG/AMP 2015 richtlijnen. Alleen pathogene of waarschijnlijk pathogene varianten in genen die op de IUIS 2024 IEI-genenlijst staan, werden als diagnostisch beschouwd.
• Validatie: Alle kandidaat-pathogene varianten ondergingen Sanger-sequencing validatie. Voor de novo varianten werden ouderlijke monsters verzameld voor trio-validatie en Short Tandem Repeat (STR) verwantschapsanalyse om de biologische afstamming te bevestigen en monsterverwisseling uit te sluiten.
• Statistische Analyse: De diagnostische opbrengst werd vergeleken met behulp van de Fisher's exact test of chi-kwadraat testen. Leeftijd werd gestratificeerd in vier groepen (0–6 maanden, 7 maanden–3 jaar, 4–8 jaar, 9–15 jaar) om de fenotypische evolutie te analyseren.

Belangrijkste Resultaten

• Diagnostische Opbrengst: WES gecombineerd met CNV-analyse leverde een moleculaire diagnose op bij 77 van de 243 kinderen (31,69%).
• Genetisch Landschap: De diagnoses betroffen 34 verschillende genen. DiGeorge syndroom (22q11.2 deletie) was de meest frequente diagnose (18 gevallen, 23,38%). Structurele variaties (CNV's) maakten 27,27% (21 gevallen) uit van alle diagnoses, waarbij 22q11.2 deleties de primaire bijdrage leverden.
• Impact van Trio Sequencing: Hoewel slechts 15 families (6,17%) een trio-gebaseerde WES ondergingen (proband plus ouders), toonde deze aanpak een significant hogere diagnostische opbrengst vergeleken met enkel proband-sequencing (60,0% versus 29,8%, p < 0,001). Dit voordeel werd grotendeels toegeschreven aan de efficiënte identificatie van de novo varianten (bijv. in KRAS, NRAS, BCL11B), die 54,55% van de bevestigde gevallen vormden.
• Leeftijd-gestratificeerde Fenotypes: De studie onthulde een dynamische, leeftijdsafhankelijke evolutie van IEI-fenotypes:
  • 0–6 maanden: Gedomineerd door ontwikkelingsstoornissen van het immuunsysteem (bijv. SCID, DiGeorge syndroom).
  • 7 maanden–3 jaar: Verschuiving naar antilichaamdeficiënties en autoinflammatoire condities.
  • 9–15 jaar: Gekenmerkt door complexe syndromale IEI, immuundysregulatie en kankerpredisponerende syndromen.
• Klinische Presentatie: Recidiverende luchtweginfecties waren het meest voorkomende symptoom (76,54%). Opvallend genoeg presenteerden 67,5% van de patiënten zich met slechts 1–3 symptomen. Zelfs patiënten met een enkel zeer suggestief symptoom bereikten een diagnostische ratio van 45%, wat de aanname uitdaagt dat uitgebreide multisysteem betrokkenheid vereist is voor genetische testen.
• Variabiliteit in Interpretatie: Een significante bevinding was de variabiliteit in diagnostische uitkomsten op basis van de bio-informatica analist. De diagnostische ratio's onder de top vijf analisten varieerden van 11,54% tot 53,33% (p = 0,00013), terwijl de verwijspatronen door clinici geen significante variatie vertoonden. Dit benadrukt dat de subjectiviteit van interpretatie een belangrijke bron is van diagnostische inconsistentie.

Betekenis en Claims
De auteurs stellen dat deze studie een schaalbaar, fenotype-gestuurd kader biedt voor genomische diagnostiek in omgevingen met beperkte middelen en etnische diversiteit. De belangrijkste bijdragen zijn:

1. Validatie van Geïntegreerde Workflows: De studie demonstreert dat het integreren van CNV-analyse in routinematige WES-workflows cruciaal is, aangezien het weglaten hiervan bijna een kwart van de pathogene laesies (specifiek CNV's zoals 22q11.2 deleties) zou missen.
2. Prioritering van Trio Sequencing: Voor hoog-risico kinderen, met name in sporadische gevallen zonder familiegeschiedenis, beargumenteren de auteurs dat trio-WES geprioriteerd moet worden als initiële test vanwege de superieure diagnostische opbrengst bij het identificeren van de novo varianten.
3. Leeftijd-gestratificeerde Strategie: De bevindingen ondersteunen de implementatie van leeftijd-gestratificeerde diagnostische strategieën, waarbij erkend wordt dat IEI zich manifesteert als een dynamisch spectrum dat evolueert van ontwikkelingsfalen in de zuigeling tot dysregulatie en maligniteit in de adolescentie.
4. Imperatief voor Standaardisatie: De studie onderstreept dat diagnostische gelijkheid en reproduceerbaarheid sterk afhangen van het standaardiseren van variant-interpretatie pipelines. De geobserveerde vijfvoudige variatie in de prestaties van analisten suggereert dat subjectieve factoren bij het toepassen van ACMG/AMP-criteria de diagnostische uitkomsten aanzienlijk kunnen veranderen, wat gestandaardiseerde training en kwaliteitsborgingskaders noodzakelijk maakt.
5. Verlagen van de Testdrempel: De hoge diagnostische opbrengst bij patiënten met een beperkte symptoomlast (zelfs bij een enkel symptoom) ondersteunt het verlagen van de drempel voor WES bij hoog-risico zuigelingen, wat potentieel de "diagnostische odyssee" kan verkorten en vroegtijdige interventie mogelijk maakt.

De auteurs concluderen dat hoewel de integratie van WES/CNV de diagnostische efficiëntie aanzienlijk verbetert, er nog steeds uitdagingen zijn, waaronder de "diagnostische kloof" voor de resterende ~68% van de niet-gediagnosticeerde patiënten, wat mogelijk te wijten is aan non-coding varianten, complexe structurele herschikkingen of nieuwe genen die nog niet gecatalogiseerd zijn. Toekomstige inspanningen moeten zich richten op het uitbreiden van lokale variantdatabases en het integreren van whole-genome sequencing en functionele analyses.