Real-World Single-Center Study of Primary Immunodeficiency in Chinese Children: Diagnostic Efficacy and Genomic Landscape Revealed by Whole-Exome Sequencing Combined with Copy Number Variant Analysis

Resumo Técnico: Estudo de Mundo Real de Centro Único sobre Imunodeficiência Primária em Crianças Chinesas

Definição do Problema
Os Erros Inatos da Imunidade (EII), anteriormente conhecidos como Doenças de Imunodeficiência Primária (DIP), representam um grupo geneticamente heterogêneo de mais de 508 distúrbios. Apesar de afetarem uma estimativa de 1% da população global, os EII permanecem profundamente subdiagnosticados, particularmente em ambientes com recursos limitados como a China, onde a proporção de casos clinicamente reconhecidos é de apenas ~5% da carga estimada. A lacuna diagnóstica é exacerbada pela alta heterogeneidade fenotípica, apresentações clínicas inespecíficas e acesso limitado a testes especializados. Consequentemente, os pacientes enfrentam diagnósticos tardios, infecções recorrentes potencialmente fatais e significativa pressão financeira. Embora o Sequenciamento do Exoma Completo (WES) tenha surgido como uma ferramenta diagnóstica transformadora, seu desempenho no mundo real, critérios ideais de seleção de pacientes e utilidade clínica em populações pediátricas asiáticas diversas — especificamente no que diz respeito à integração da análise de Variantes de Número de Cópias (CNV) e sequenciamento trio — permanecem inadequadamente caracterizados.

Metodologia
Este estudo retrospectivo de centro único foi conduzido no Hospital de Saúde Materno-Infantil de Guangxi (Nanning, China) entre janeiro de 2020 e setembro de 2025. A coorte consistiu em 243 pacientes pediátricos (com idades entre 10 dias e 15 anos) clinicamente suspeitos de possuir EII com base em critérios estabelecidos de "sinais de alerta", incluindo infecções recorrentes/graves, padrões de infecção atípicos, envolvimento multissistêmico ou evidência laboratorial de desregulação imunológica.

• Sequenciamento e Bioinformática: Todos os participantes foram submetidos ao WES utilizando o kit Agilent SureSelect Clinical Research Exome V2 na plataforma Illumina HiSeq 2500 (profundidade média ~255×). As leituras brutas foram alinhadas ao GRCh37/hg19.
• Detecção de CNV: Um método baseado na profundidade de cobertura foi empregado para detectar CNVs diretamente dos dados de WES. As profundidades de leitura normalizadas foram calculadas por éxon, e as CNVs candidatas foram identificadas como segmentos genômicos abrangendo pelo menos três éxons consecutivos com cobertura normalizada desviando-se significativamente da linha de base específica do lote (|Z-score| > 3).
• Classificação de Variantes: As variantes candidatas foram triadas usando a plataforma TGex e classificadas de acordo com as diretrizes ACMG/AMP 2015. Apenas variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas em genes listados na lista de genes de EII da IUIS 2024 foram consideradas diagnósticas.
• Validação: Todas as variantes candidatas patogênicas passaram por validação por sequenciamento Sanger. Para variantes de novo, amostras parentais foram coletadas para validação trio e análise de parentesco por Short Tandem Repeat (STR) para confirmar a ascendência biológica e descartar confusões de amostras.
• Análise Estatística: Os rendimentos diagnósticos foram comparados utilizando o teste exato de Fisher ou testes qui-quadrado. A idade foi estratificada em quatro grupos (0–6 meses, 7 meses–3 anos, 4–8 anos, 9–15 anos) para analisar a evolução fenotípica.

Resultos Principais

• Rendimento Diagnóstico: O WES combinado com a análise de CNV resultou em um diagnóstico molecular em 77 de 243 crianças (31,69%).
• Panorama Genético: Os diagnósticos envolveram 34 genes distintos. A síndrome de DiGeorge (deleção 22q11.2) foi o diagnóstico mais frequente (18 casos, 23,38%). Variações estruturais (CNVs) representaram 27,27% (21 casos) de todos os diagnósticos, sendo a deleção 22q11.2 o principal contribuinte.
• Impacto do Sequenciamento Trio: Embora apenas 15 famílias (6,17%) tenham passado por WES baseado em trio (próbande mais pais), esta abordagem demonstrou um rendimento diagnóstico significativamente maior em comparação ao sequenciamento apenas do próbande (60,0% vs. 29,8%, p < 0,001). Esta vantagem foi amplamente atribuída à identificação eficiente de variantes de novo (ex: em KRAS, NRAS, BCL11B), que constituíram 54,55% dos casos confirmados.
• Fenótipos Estratificados por Idade: O estudo revelou uma evolução dinâmica e dependente da idade dos fenótipos de EII:
  • 0–6 meses: Dominado por imunodeficiências de desenvolvimento (ex: SCID, síndrome de DiGeorge).
  • 7 meses–3 anos: Mudança para deficiências de anticorpos e condições autoinflamatórias.
  • 9–15 anos: Caracterizado por EII sindrômicos complexos, desregulação imunológica e síndromes de predisposição ao câncer.
• Apresentação Clínica: Infecções respiratórias recorrentes foram o sintoma mais comum (76,54%). Notavelmente, 67,5% dos pacientes apresentaram apenas 1 a 3 sintomas. Mesmo pacientes com um único sintoma altamente sugestivo alcançaram uma taxa diagnóstica de 45%, desafiando a suposição de que o envolvimento multissistêmico extensivo é necessário para o teste genético.
• Variabilidade de Interpretação: Um achado significativo foi a variabilidade nos resultados diagnósticos com base no analista de bioinformática. As taxas diagnósticas entre os cinco principais analistas variaram de 11,54% a 53,33% (p = 0,00013), enquanto os padrões de encaminhamento pelos clínicos não mostraram variação significativa. Isso destaca que a subjetividade da interpretação é uma grande fonte de inconsistência diagnóstica.

Significância e Alegações
Os autores afirmam que este estudo fornece um framework de diagnóstico genômico escalável e orientado pelo fenótipo em ambientes etnicamente diversos e com recursos limitados. As principais contribuições incluem:

1. Validação de Fluxos de Trabalho Integrados: O estudo demonstra que integrar a análise de CNV aos fluxos de trabalho rotineiros de WES é crítico, pois a omissão desta ignoraria quase um quarto das lesões patogênicas (especificamente CNVs como deleções 22q11.2).
2. Priorização do Sequenciamento Trio: Para crianças de alto risco, particularmente em casos esporádicos sem histórico familiar, os autores argumentam que o WES trio deve ser priorizado como um teste inicial devido ao seu rendimento diagnóstico superior na identificação de variantes de novo.
3. Estratégia Estratificada por Idade: Os achados apoiam a implementação de estratégias diagnósticas estratificadas por idade, reconhecendo que o EII se manifesta como um espectro dinâmico que evolui de falhas de desenvolvimento na infância para desregulação e malignidade na adolescência.
4. Imperativo de Padronização: O estudo ressalta que a equidade e a reprodutibilidade diagnóstica dependem fortemente da padronização dos pipelines de interpretação de variantes. A variação de cinco vezes observada no desempenho dos analistas sugere que fatores subjetivos na aplicação dos critérios ACMG/AMP podem alterar significativamente os resultados, necessitando de treinamento padronizado e estruturas de garantia de qualidade.
5. Redução dos Limiares de Testagem: O alto rendimento diagnóstico em pacientes com cargas de sintomas limitadas (mesmo com um único sintoma) apoia a redução do limiar para WES em lactentes de alto risco, potencialmente encurtando a "odisséia diagnóstica" e permitindo intervenção precoce.

Os autores concluem que, embora a integração WES/CNV melhore significativamente a eficiência diagnóstica, permanecem desafios, incluindo a "lacuna diagnóstica" para os cerca de 68% de pacientes não diagnosticados, que pode envolver variantes não codificantes, rearranjos estruturais complexos ou novos genes ainda não catalogados. Esforços futuros devem focar na expansão de bancos de dados de variantes locais e na integração de sequenciamento de genoma completo e análises funcionais.