Programmable RNA targeting with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) effector Cas7-11 in zebrafish embryos and mammalian cells

Stel je voor dat je lichaam een enorme, bruisende bibliotheek is waar elk boek instructies bevat voor het bouwen en laten functioneren van een levend organisme. Soms wil je een specifiek boek tijdelijk verbergen om te zien wat er gebeurt als de instructies in dat boek niet worden gelezen. Dit is de basis van gene knockdown: het volume van een specifiek gen omlaag draaien zonder het boek zelf te verwijderen.

Lange tijd hadden wetenschappers instrumenten om dit te doen, maar het waren als botte instrumenten. Sommigen waren te giftig (zoals een moker gebruiken om een noot te kraken), anderen werkten niet goed in bepaalde dieren (zoals proberen een sleutel te gebruiken die alleen op één specifieke deur past), of ze beschadigden per ongeluk andere boeken in de kast (veroorzaakten "off-target" schade).

Maak kennis met Cas7-11, een nieuwe, uiterst precieze "bibliothecaris" die de onderzoekers in dit artikel hebben getest in twee zeer verschillende bibliotheken: zebrafischembryo's (kleine, transparante visbaby's) en menselijke stamcellen (de meestercellen die in elk deel van het lichaam kunnen veranderen).

Hier is wat zij ontdekten, eenvoudig uitgelegd:

1. Het probleem met de oude instrumenten

Voordat deze studie plaatsvond, hadden wetenschappers een paar manieren om genen te stilleggen:

• DNA-bewerking (zoals CRISPR-Cas9): Dit is alsof je een schaar gebruikt om een pagina uit het boek zelf te knippen. Het is permanent. Als je een fout maakt, is het boek voor altijd geruïneerd.
• RNA-interferentie (RNAi): Dit is alsof je een "Niet lezen"-bordje op een boek plaatst. Het werkt goed bij mensen, maar faalt jammerlijk bij vissen en kikkers.
• Morpholino's: Dit zijn chemische blokkeerders. Ze werken goed bij vissen, maar kunnen toxisch zijn en ervoor zorgen dat de vissen ziek worden of vreemd ontwikkelen om redenen die niets met het bestudeerde gen te maken hebben.
• Cas13 (een oudere RNA-bewerker): Dit is een scherp instrument, maar het is een beetje onhandig; het knipt soms ook andere boeken in de buurt kapot terwijl het probeert de doelgerichte tekst te knippen.

2. Het nieuwe instrument: Cas7-11

De onderzoekers wilden weten of Cas7-11 de "perfecte bibliothecaris" was. In tegen tegenstelling tot de anderen, is Cas7-11 ontworpen om een specifieke zin in het RNA (de kopie van de instructies van het boek) te vinden en deze kapot te knippen, waardoor de cel de instructies effectief niet meer kan lezen. Cruciaal is dat het het originele DNA-boek niet aanraakt en dat het bedoeld is om heel voorzichtig te zijn zodat het niet andere zinnen in de buurt doorknipt.

3. Testen in de visbak (Zebrafischembryo's)

Het team injecteerde de Cas7-11 "bibliothecaris" en zijn "zoekgids" in kleine zebrafischembryo's. Ze testten het op drie verschillende "boeken":

• Het "Glow-in-the-Dark" boek (EGFP): Ze injecteerden vissen met een gen dat ze groen laat oplichten. Wanneer ze Cas7-11 toevoegden, vervaagde de gloed aanzienlijk (het daalde naar ongeveer 32% van normaal). Dit bewees dat het instrument een doelwit kon vinden en stilleggen.
• Het "Staart" boek (tbxta): Dit gen vertelt de vis hoe hij een staart moet groeien. Toen Cas7-11 dit gen stilleggde, groeiden de vissen op zonder staart (of met een zeer korte staart). Dit is een bekend effect van het stilleggen van dit gen, wat bewees dat het instrument werkte.
  • De "Rescue" test: Om te bewijzen dat het geen giftig ongeluk was, voegden ze een "reservekopie" van het staartgen toe die Cas7-11 niet kon vinden. De vissen groeiden weer staarten! Dit bevestigde dat Cas7-11 specifiek het oorspronkelijke gen aanpakte en niet gewoon de vis beschadigde.
• Het "Pigment" boek (Tyrosinase): Dit gen maakt vissen donker. Wanneer dit werd uitgeschakeld, werden de vissen bleek. Het coole eraan? De vissen kregen hun kleur uiteindelijk weer terug. Dit toonde aan dat Cas7-11 transient (tijdelijk) is — het is een tijdelijke pauzeknop, geen permanente gum.

De veiligheidscontrole: Ze sequentieerden de volledige bibliotheek van de vissen (RNA-sequencing) en ontdekten dat bijna geen enkele andere "boek" per ongeluk was beschadigd. Het instrument was precies.

4. Testen in het menselijke cel-lab

Vervolgens verhuisden ze naar menselijke cellen, specifru menselijke embryonale stamcellen (de cellen die menselijk hart, hersenen of huid kunnen worden).

• De "Luciferase" test: Ze gebruikten een gen dat een lichtgevend eiwit maakt (zoals een vuurvliegje). Cas7-11 slaagde erin het licht in menselijke cellen te dimmen, wat bewees dat het ook in onze biologie werkt.
• De "Identiteit" test: Stamcellen hebben speciale "identiteitskaarten" (genen genaamd OCT4 en SOX2) die hen vertellen om stamcellen te blijven. Toen de onderzoekers Cas7-11 gebruikten om deze identiteitskaarten te verzwijgen, stopten de stamcellen met zich als stamcellen te gedragen en begonnen ze te veranderen in andere typen cellen. Dit bewees dat het instrument complex menselijk celgedrag kan controleren.
• Geen nevenschade: Net als bij de vis controleerden ze of Cas7-11 niet per ongeluk de "buurgenen" kapot had geknipt. Dat deed het niet. Het was chirurgisch nauwkeurig.

5. De "Hoe-te-doen" hindernis

De onderzoekers liepen aanvankelijk tegen een klein probleem aan. Wanneer ze probeerden het Cas7-11 eiwit in vissen te maken, was het onzichtbaar (de vissen konden de instructies niet "lezen" om het eiwit te maken). Ze moesten de instructies omwikkelen met een speciale "translatie-booster" (met behulp van delen van genen van kikkers) om de machinerie van de vis te laten begrijpen hoe het instrument gebouwd moest worden. Zodra ze dat deden, werkte alles perfect.

De essentie

Dit artikel laat zien dat Cas7-11 een krachtig, veilig en precies instrument is om het volume van specifieke genen omlaag te draaien in zowel vissen als menselijke cellen.

• Het werkt in zebrafis (een cruciaal model voor ontwikkeling).
• Het werkt in menselijke stamcellen (cruciaal voor regeneratieve geneeskunde).
• Het is tijdelijk (ideaal voor het bestuderen van ontwikkeling zonder permanente veranderingen).
• Het is veilig (lijkt de cel niet te beschadigen of de verkeerde dingen door te knippen).

De auteurs concluderen dat Cas7-11 een veelzijdige nieuwe toevoeging is aan de gereedschapskist van de wetenschapper, die een schonere en veiligere manier biedt om te bestuderen hoe genen werken tijdens de vroege stadia van het leven en in stamcellen, zonder de risico's van permanente DNA-bewerking of de toxiciteit van oudere methoden.