One-step decellularization of porcine uterine tissue for developing alginate-decellularized uterine ECM hydrogel for uterine tissue engineering

Resumo Técnico: Descelularização de Etapa Única de Tecido Uterino Suíno para o Desenvolvimento de Hidrogel de Alginato–Matriz Extracelular Uterina Descelularizada

Definição do Problema
A engenharia de tecido uterino possui potencial para tratar a infertilidade, anomalias congênitas e complicações decorrentes de cesáreas, como a cicatriz uterina. No entanto, uma barreira significativa permanece no desenvolvimento de biomateriais que possuam simultaneamente biocompatibilidade adequada, integridade mecânica e reprodutibilidade para a fabricação de constructos 3D porosos. Embora a matriz extracelular uterina descelularizada (dUECM) ofereça pistas estruturais e bioquímicas essenciais, ela sofre de baixa resistência mecânica, o que limita sua utilidade como arcabouço (scaffold) isolado. Além disso, os protocolos de descelularização tradicionais frequentemente envolveem tratamentos com detergentes sequenciais de múltiplas etapas que duram até uma semana. Esses processos prolongados podem levar à perda de componentes bioativos cruciais, como os glicosaminoglicanos (GAGs), e alterar a composição bioquímica da ECM. Adicionalmente, há uma carência de estratégias relatadas para combinar dUECM com polímeros imprimíveis para criar bio tintas híbridas que integrem a bioatividade com a imprimibilidade necessária para a bioimpressão 3D baseada em extrusão.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem sistemática para desenvolver um hidrogel híbrido bioativo para engenharia de tecido uterino:

1. Descelularização de Etapa Única: Tecidos uterinos suínos foram processados utilizando um protocolo de detergente simultâneo de etapa única combinando 1% de Triton™ X-100 com concentrações variadas de dodecil sulfato de sódio (SDS) (0,1%, 0,5%, 1% e 1,5%) por durações de 48 ou 72 horas. Isso visou reduzir o tempo de processamento enquanto equilibrava a remoção celular e a preservação da ECM.
2. Caracterização da dUECM: Os tecidos descelularizados resultantes foram rigorosamente avaliados por meio de:
   • Ensaios bioquímicos: Quantificação de DNA (para avaliar a imunogenicidade), quantificação de GAG (ensaio DMMB) e quantificação de SDS residual (ensaio MBAS).
   • Histologia e Microscopia: Coloração de H&E, DAPI, Tricrômio de Masson e Sirius Red (sob luz polarizada) para avaliar a remoção de células, distribuição de colágeno e organização das fibras. A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foi utilizada para análise ultraestrutural.
   • Espectroscopia: Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e Raman foram utilizadas para avaliar a organização molecular, a integridade da tripla hélice do colágeno e a preservação de grupos funcionais.
   • Testes Mecânicos: Testes de tração foram realizados em lâminas de tecido descelularizado para determinar a resistência à tração última (UTS), o módulo de Young e o alongamento na ruptura.
3. Formulação da Tinta de Hidrogel: A dUECM ideal foi digerida enzimaticamente com pepsina e misturada com alginato de sódio (2% e 3% p/v) para criar tintas imprimíveis.
4. Bioimpressão 3D e Avaliação Físico-Química: Os construtos foram fabricados utilizando impressão 3D baseada em extrusão. O estudo avaliou a imprimibilidade (fidelidade do filamento), comportamento de inchamento, perfis de degradação (retenção de massa ao longo de 14 dias) e propriedades mecânicas (módulo de compressão) dos arcabouços impressos.
5. Desempenho Biológico: A biocompatibilidade do hidrogel otimizado (3% Alg + 1,5% dUECM) foi avaliada usando células miometriais uterinas humanas (hTERT-HM). As avaliações incluíram ensaios metabólicos MTT, coloração Live/Dead e coloração imuno-histoquímica para α-actina de músculo liso suave (α-SMA) durante 7 dias.

Principais Resultados

• Eficiência de Descelularização: O protocolo utilizando 1% de Triton™ X-100 e 1% de SDS por 48 horas (T1% + S1% - 48h) foi identificado como o ideal. Ele reduziu o conteúdo de DNA para 51,3 ± 9 ng/mg (marginalmente acima do limiar de 50 ng/mg, mas confirmado como altamente fragmentado, sem bandas de alto peso molecular) enquanto reteve altos níveis de GAGs (54,9 ± 7,6 μg/mg). Esse equilíbrio preservou a integridade estrutural do colágeno e as propriedades mecânicas melhor do que protocolos mais agressivos (ex: 1,5% de SDS ou tratamentos de 72 horas), que causaram depleção significativa de GAGs e desorganização do colágeno.
• Propriedades do Hidrogel: O hidrogel 3% Alg + 1,5% dUECM demonstrou imprimibilidade adequada, com um fator de imprimibilidade de 1,56 ± 0,20. Apresentou inchamento controlado (47 ± 12%) e alta resistência à degradação, retendo 94 ± 18% de sua massa após 14 dias. Mecanicamente, o arcabouço manteve a rigidez ao longo do tempo, com o módulo de compressão diminuindo de 323 kPa para 175 kPa ao longo de 14 dias, indicando estabilidade estrutural.
• Desempenho Biológico: O hidrogel otimizado aumentou significativamente a viabilidade e a proliferação celular em comparação com os controles de apenas alginato. No dia 7, as células hTERT-HM no hidrogel 3% Alg + 1,5% dUECM mostraram um aumento de 258 ± 13% na atividade metabólica. Os ensaios Live/Dead confirmaram alta viabilidade, e a imuno-coloração revelou que as células adotaram uma morfologia alongada, do tipo fusiforme, com expressão organizada de α-SMA, indicativa de um fenótipo de músculo liso preservado.

Significância e Alegações
O artigo alega que o protocolo de descelularização de etapa única desenvolvido oferece uma alternativa simplificada aos métodos tradicionais de múltiplas etapas, reduzindo efetivamente o tempo de processamento e a exposição aos reagentes, enquanto preserva componentes essenciais da ECM. O estudo demonstra que a mistura de dUECM com alginato cria um hidrogel híbrido que supera as limitações de imprimibilidade da dECM pura e a falta de bioatividade do alginato puro.

Os autores postulam que o hidrogel 3% Alg + 1,5% dUECM resultante fornece uma plataforma promissora para a engenharia de tecido uterino. Ele suporta a bioimpressão 3D de construtos com forte desempenho mecânico e a capacidade de suportar o crescimento, proliferação e manutenção do fenótipo de células miometriais uterinas humanas. O trabalho estabelece as bases para o desenvolvimento futuro de construtos uterinos biofabricados e personalizados, abordando a necessidade crítica de biomateriais que sejam tanto biologicamente instrutivos quanto mecanicamente adequados para a bioimpressão 3D. O estudo permanece modesto em seu escopo, focando na validação in vitro e caracterização físico-química, e observa que estudos adicionais são necessários para avaliar a segurança imunológica em relação a xenoantígenos (como o α-Gal) e a funcionalidade in vivo.